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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Erzeugung der Ileumschleife
- Hautvorbereitung: Peeling des Fells der Bauchmittellinie mit Alkoholtupfern oder Mullschwamm, der mit 70% Ethanol getränkt ist. Befeuchten Sie eine große Fläche des Fells nicht mit Alkohol, um eine Unterkühlung zu vermeiden.
- Führen Sie mit einer Schere eine Mittellinien-Laparotomie durch. Machen Sie einen vertikalen Schnitt in der Mitte des Bauches (ca. 2 cm lang) und legen Sie das Bauchfell frei. Achten Sie darauf, die intraabdominalen Organe nicht zu verletzen.
- Legen Sie vorgeschnittene nasse Baumwollgaze über die freiliegende intraabdominale Höhle.
- Verwende feuchte Wattestäbchen, um den Blinddarm zu mobilisieren und nach außen zu verkörpern. Lege den Blinddarm vorsichtig auf die feuchte Baumwollgaze.
Anmerkung: Der Blinddarm ist bei den meisten Mäusen unabhängig vom Geschlecht des Tieres im linken kaudalen Quadranten der Bauchhöhle lokalisiert.
- Verwenden Sie feuchte Wattestäbchen, um das Ileum, dessen terminaler Abschnitt (distales Ende) am Blinddarm befestigt ist, mit feuchten Wattestäbchen zu mobilisieren und vorsichtig nach außen zu führen (Abbildung 1B).
- Bringen Sie mindestens 6 cm terminales Ileum auf die nasse Baumwollgaze auf, ohne die Mesenterialgefäße und die Blutversorgung zu stören. Die Blutversorgung bleibt erhalten, wenn keine Blutungen auftreten und das Gewebe seine rosa Farbe behält (Abbildung 1B).
Anmerkung: Vermeiden Sie das Austrocknen des freiliegenden Gewebes, indem Sie das Gewebe die ganze Zeit mit warmem HBSS (alle 2 - 3 Minuten) feucht halten, indem Sie eine 10-ml-Spritze verwenden, die an einer gelben Ernährungssonde befestigt ist.
- Identifizieren Sie in der Nähe des Blinddarms die Hauptarterie im Mesenterium, die das Ileum mit Blut versorgt. Suchen Sie dann zwei Ligaturstellen im Mesenterium, die frei von kritischen Blutgefäßen sind.
- Fassen Sie mit einer stumpfen Gewebezange das terminale Ileum (das dem Blinddarm am nächsten liegt) fest und fenestrieren Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze das Mesenterium, um Blutgefäße zu vermeiden. Legen Sie eine Seidennaht über die Perforation und binden Sie einen chirurgischen Knoten, um die erste Ligatur (distales Ende der Schlaufe) zu erzeugen.
- Messen Sie mit dem Lineal 4 cm von der ersten Ligatur entfernt und erstellen Sie die zweite Ligatur (proximales Ende der Schlaufe), wie in Schritt 2.8 beschrieben (Abbildung 1C).
- Schneiden Sie mit einer feinen Schere vorsichtig neben jede Ligatur, um die 4 cm lange Ileumschlinge zu isolieren, wobei die Blutversorgung und die Mesenterialmembran intakt bleiben.
Anmerkung: Schneiden Sie beide Enden des exteriorisierten Segments des iLoops ab und spülen Sie dann vorsichtig als notwendigen Schritt, um eine Interferenz mit dem luminalen Inhalt (Kot) zu verhindern und so eine gleichmäßige Verteilung von FITC-Dextran oder chemotaktischen Stimuli über die gesamte Länge des isolierten Segments zu erleichtern und eine genauere Quantifizierung der Leukozyten durch Durchflusszytometrie zu ermöglichen. Dieses Verfahren ermöglicht auch eine gleichmäßige Dehnung der Schleimhaut nach Injektion bestimmter Reagenzmengen und eine bessere Reproduzierbarkeit zwischen Tieren.
- Spülen Sie den Inhalt des Ileumschleifensegments vorsichtig mit warmem HBSS mit einer flexiblen gelben Ernährungssonde, die an einer 10-ml-Spritze befestigt ist.
- Libertieren Sie die beiden abgeschnittenen Enden der geröteten Ileumschlaufe mit Seidennaht.
- Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze mit einer 30-g-Nadel, um langsam 250 μl Reagenz wie FITC-Dextran oder Chemokin in das Darmlumen zu injizieren. Die Ileumschlinge bläht sich auf, was zu einer mäßigen Dehnung der Schleimhaut führt (Abbildung 1D).
Anmerkung: Injizieren Sie das Reagenz in das Schlingenlumen auf der gegenüberliegenden Seite der Arteria mesenterialis. Achten Sie darauf, die Ileumschlinge während der Injektion nicht aus dem Tier herauszuziehen, um ein Einreißen der Blutgefäße und Blutungen zu vermeiden.
- Setzen Sie mit feuchten Wattestäbchen die Ileumschlaufe, das proximale Ileum und den Blinddarm vorsichtig zurück.
- Verwenden Sie einen Nadelhalter, eine anatomische Pinzette und 3.0 nicht resorbierbare Seidennähte mit umgekehrter Schnittnadel, um die Bauchdecke zu schließen.
- Legen Sie das Tier für die Inkubationszeit in eine temperaturgeregelte Anästhesiekammer.
