Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. EDL-Muskelisolierung und Kollagenase-Verdauung
- Besprühen Sie alle Geräte mit 70 % Ethanol, um eine Kontamination zu vermeiden.
- Opfern Sie die Maus gemäß den nationalen Vorschriften für Tierversuche.
- Besprühen Sie die Hinterbeine der Maus mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine gehärtete feine gebogene Schere (24 mm Schneide) und eine feine Pinzette (Dumont 7, gebogen oder gerade), um die Haut zu entfernen und die darunter liegende Muskulatur freizulegen. Vermeiden Sie jeglichen Kontakt der darunter liegenden Muskeln mit dem Fell (erhöht das Risiko einer Kontamination).
- Entfernen Sie die umgebende Faszie mit einer fein gebogenen Pinzette, ohne die darunter liegende Muskulatur zu beschädigen (Abbildung 1A). Schließen Sie die Pinzette, um ein Verbiegen zu vermeiden.
- Verwenden Sie eine gekrümmte Pinzette, um die distalen Sehnen des Musculus TA (Tibialis anterior) und des EDL-Muskels freizulegen. Um die TA zu entfernen, die distale TA-Sehne mit einer Pinzette greifen und mit einer feinen Vannas Federschere (5 mm Schneide, 0,35 mm Spitzendurchmesser) schneiden. Während man den TA an der Sehne hält, ihn in Richtung Knie zieht und den Muskel nahe am Knie durchtrennt (Abbildung 1B), liegt nun der EDL-Muskel frei.
Anmerkung: Achten Sie darauf, dass in diesem Schritt nur die TA-Sehne gegriffen wird, da sonst die darunterliegende EDL beschädigt werden kann. Beim Abtrennen des TA-Muskels ist darauf zu achten, dass die Sehnen am Knie im Nachhinein gut zu sehen sind.
- Heben Sie die distale EDL-Sehne mit einer feinen gebogenen Pinzette an und schneiden Sie mit einer feinen Vannas-Federschere (Abbildung 1C). Legen Sie die proximale EDL-Sehne frei, indem Sie die EDL vorsichtig in Richtung Knie ziehen. Schneiden Sie die proximale Sehne mit einer feinen Federschere von Vannas ab. Übertragen Sie den EDL-Muskel in die auf 37 °C vorgewärmte 2,5 ml Kollagenase-Aufschlusslösung in das 15-ml-Reaktionsröhrchen. Die Kollagenase-Lösung wird nach folgendem Verfahren hergestellt:
- Bereiten Sie eine Kollagenase-Aufschlusslösung her, indem Sie 0,2 % (w/v) Kollagenase Typ 1 (aus Clostridium histolyticum) in DMEM (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit 4,5 g/L Glukose und Natriumpyruvat) lösen und durch einen 0,22-μm-Filter filtrieren. (Abbildung 1D).
Anmerkung: Machen Sie einen kleinen Schnitt am äußeren Kniebindegewebe, um die proximale EDL-Sehne vollständig freizulegen. Achten Sie darauf, nur die Sehnen zu greifen und den EDL nicht zu stark zu dehnen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.3. bis 1.6 mit der zweiten EDL. Geben Sie beide EDL-Muskeln in dasselbe 15-ml-Reaktionsröhrchen, das mit 2,5 mL Kollagenase-Aufschlusslösung gefüllt ist.
- Die EDL-Muskulatur im Reaktionsröhrchen bei 37°C in einem zirkulierenden Wasserbad inkubieren.
Anmerkung: Die Inkubationszeit hängt von mehreren Faktoren ab, wie z. B. der Kollagenaseaktivität, dem Alter der Maus und der Menge an fibrotischem Gewebe. Die typische Inkubationszeit für EDL-Muskeln von adulten Mäusen (im Alter von 2-6 Monaten) beträgt 1-1,5 h und für gealterte Mäuse (im Alter von 18 Monaten) 1,5-2 h.
- Um eine übermäßige Verdauung der Muskeln zu vermeiden, kontrollieren Sie die Muskeln während der Verdauungszeit. Stoppen Sie die Verdauung, wenn sich die Muskeln lockern und einzelne Myofasern sichtbar sind (Abbildung 1E). Übertragen Sie die Muskeln vorsichtig mit der Pipette mit großem Durchgang in die erste Vertiefung der vorgewärmten 12-Well-Platte mit dem Myofaser-Isolationsmedium (Abbildung 1G), die wie folgt vorbereitet wird:
- DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium mit 4,5 g/L Glucose und Natriumpyruvat) mit 20% FBS (fetales Rinderserum) ergänzen, durch 0,22 μm Filter filtrieren. Geben Sie etwa 30 Minuten vor der Isolierung Medium zu den vorbeschichteten Isolationsplatten (12-Well-Platte, 2-4 mL Isolationsmedium pro Well) und äquilibrieren Sie in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit 5 % CO2.
>2. Dissoziation von Myofasern
- Für die folgenden Schritte verwenden Sie ein Stereo-Binokularmikroskop, das vorzugsweise mit einer Heizplatte (37 °C) ausgestattet ist. Verwenden Sie die Pipette mit großem Durchmesser, um die Muskeln mit warmem Isolationsmedium zu spülen, bis einzelne Myofasern freigesetzt werden. Dissoziieren Sie die Muskeln mit der Pipette mit großem Durchgang, bis die gewünschte Anzahl von Myofasern frei in der Lösung schwimmt.
Anmerkung: Vermeiden Sie übermäßige Verreibung, um das Risiko beschädigter Myofasern zu verringern. Die Verwendung einer Heizplatte für die Dissoziation von Myofasern wird dringend empfohlen, da die Temperatur während des Isolationsprozesses sinkt, was zum Absterben der Myofaser führt.
