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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Sterile Glasnadeln
- Schalten Sie den Nadelpipettenabzieher ein.
- Stellen Sie den Heizknopf ein, bis auf dem Display 12.6 angezeigt wird.
- Öffnen Sie die Tür und führen Sie das 5-μl-Kapillarrohr manuell durch die obere Klemme und das Heizfilament, bis die Hälfte des Schlauchs unter das Filament hinausragt (Abbildung 1A).
- Vergewissern Sie sich, dass sich das Kapillarrohr in der "V"-Nut in der oberen Klemme befindet. Ziehen Sie die obere Klemme fest.
- Stellen Sie bei geöffneter unterer Klemme den vertikalen Schieber manuell nach oben, bis die untere Klemme ihre obere Grenze erreicht. Vergewissern Sie sich, dass sich der Schlauch in der "V"-Nut in der unteren Klemme befindet. Ziehen Sie die untere Klemme fest.
- Schließen Sie die Tür und vergewissern Sie sich, dass die Bereitschaftsleuchte leuchtet. Drücken Sie die Starttaste, um die Heiz- und Zugsequenz zu starten (Abbildung 1B).
- Stellen Sie sicher, dass sich die Heizung automatisch ausschaltet, nachdem Hitze und Schwerkraft das Kapillarrohr auseinandergezogen haben (Abbildung 1C) und sich der Schieber nach unten bewegt.
- Öffnen Sie die Tür. Halten Sie die Oberseite des Kapillarrohrs fest und lösen Sie die obere Klemme. Entfernen Sie das obere Kapillarrohr und legen Sie es beiseite.
- Halten Sie das Kapillarrohr im unteren Schieber fest und lösen Sie die untere Klemme. Entfernen Sie das untere Kapillarrohr und legen Sie es beiseite.
- Verwenden Sie einen Mikroelektrodenanfaser mit einer 0,05 μm Aluminiumoxid-Schleifplatte, um das gezogene Kapillarrohr abzuschrägen und die Injektionsnadeln herzustellen.
- Pipettieren Sie so viel Wasser auf die Schleifplatte, dass die Oberfläche bedeckt ist (Abbildung 1D).
- Schalten Sie den Fasen so ein, dass er sich mit 60 U/min zu drehen beginnt. Setzen Sie das gezogene Kapillarrohr in die Pipettenklemme in der "V"-Nut ein. Ziehen Sie die Klemme fest und stellen Sie den Winkel der Pipettenklemme auf 30° ein.
- Stellen Sie die Spitze der spitzen Kante des Kapillarrohrs etwa zwei Drittel vom Drehpunkt der Schleifplatte entfernt ein.
- Senken Sie das geklemmte Kapillarrohr ab, indem Sie den groben Drehknopf an der Oberseite des Manipulators einstellen. Senken Sie das Kapillarrohr weiter ab, bis die Spitze des Kapillarrohrs unter die Wasseroberfläche ragt und die abrasive Oberfläche der Schleifplatte berührt.
- Überwachen Sie den Anfasfortschritt mit dem Mikroskop, das an der Anfasmaschine angebracht ist. Stellen Sie nach 5 Minuten den Feinregler ein, um die Glasnadel von der Schleifplatte zu heben.
- Entfernen Sie die Glasnadel und halten Sie sie unter 10-fache Vergrößerung, um die Spitze des Kapillarrohrs zu überprüfen (Abbildung 1E,F).
- Um sicherzustellen, dass es keine Verstopfungen gibt, führen Sie die Glasnadel in einen Pipettenhalter an einer Spritze ein und drücken Sie Luft in ein 1-ml-Röhrchen mit 99 % Ethanol. Wenn sich Luftblasen an der Nadelspitze bilden, hat die Nadel keine Verstopfungen und kann für die Mikroinjektion verwendet werden. Dieses Verfahren stellt auch die Sterilität der Glasnadeln sicher.
- Ein Kapillarröhrchen kann bis zu 5 μl Flüssigkeit aufnehmen. Markieren Sie das Kapillarrohr in 10 Abschnitte, um die Abstände auf der Nadel zu berechnen, die für ein Volumen von 0,5 μl markiert werden sollen. Markieren Sie eine Skala mit dem Abstand, der 0,5 μl für die zukünftige Zubereitung fasst. Bei einer 5-μl-Nadel entsprechen Abstände von 0,7 mm einem Abstand von 0,5 μl (Abbildung 1G).
>2. Intravitreale Injektion der Maus
- Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 durch.
- Bereiten Sie die Eingriffsstelle vor, indem Sie medizinische Unterlagen auf den Operationstisch legen.
- Schalten Sie den Mikroinjektor ein und öffnen Sie das Gasventil am Druckluftbehälter, der an den Mikroinjektor angeschlossen ist. Stellen Sie den Tankregler so ein, dass die Gaszufuhr ca. 60 psi beträgt.
- Drücken Sie am Mikroinjektor auf Mode, bis auf dem Bildschirm Balance angezeigt wird. Drücken Sie Balance und legen Sie die Computermaus auf den Operationstisch. Verbinden Sie den Pipettenhalter aus Edelstahl mit dem Schlauch, der an "Fill/Output" des Injektors befestigt ist. Dieser Schlauch ist immer mit dem Injektor verbunden.
- Führen Sie die Kapillarnadel in das andere Ende des Pipettenhalters ein, indem Sie den Pipettenhalterverbinder um die Nadel festschrauben.
- Schalten Sie das Augenmikroskop ein und schalten Sie sein Licht mit einer Intensität von 50 % ein. Stellen Sie das Mikroskop über die Eingriffsstelle auf dem OP-Tisch ein und stellen Sie das Mikroskop auf den gewünschten Fokus ein.
- Vergewissern Sie sich vor Beginn des Eingriffs, dass die Maus ausreichend betäubt ist, indem Sie den Pedalrückzugsreflex testen. Achten Sie darauf, dass Sie Ihr von der IACUC genehmigtes Protokoll für die Anästhesie befolgen.
- Legen Sie die betäubte Maus mit der Nase nach rechts und der linken Seite auf die medizinischen Unterpolster.
- Betrachten Sie das rechte Auge der Maus durch das ophthalmologische Mikroskop und öffnen Sie die Lider, indem Sie die Zange einer umgekehrt wirkenden Pinzette auf beiden Seiten des Auges öffnen, um die Injektionsstelle freizulegen (Abbildung 2C).
- Füllen Sie die Kapillarnadel mit der Bakterienlösung Bacillus cereus (ATCC 14579) (200 KBE/μl Verdünnung), indem Sie mit der linken Maustaste auf das Mauspad klicken, das mit dem Mikroinjektor verbunden ist (Abbildung 2D).
- Befestigen Sie den Kopf des Tieres mit der linken Hand und platzieren Sie die Nadelspitze am Limbus des Auges. Mit der Nadel in abgeschrägter Position und im 45°-Winkel das Mausauge punktieren, aber darauf achten, dass beim Injizieren nur die scharfe Spitze der Nadel (~0,5 mm) eingeführt wird.
- Sobald die Nadelspitze eingeführt ist, bewegen Sie die linke Hand vom Mauskopf zum Mauspad und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Mauspad, um 0,5 μl der B. cereus-Verdünnung zu injizieren, die in der Brain Heart Infusion (BHI)-Brühe hergestellt wurde. Um ein Auslaufen zu vermeiden, lassen Sie die Nadelspitze 2-3 Sekunden lang im Mausauge, bevor Sie sie entfernen (Abbildung 2E).
- Lassen Sie die Pinzette los und setzen Sie die Maus in einen Käfig, der auf einem Wärmekissen sitzt. Überwachen Sie diese Mäuse, bis sie sich von der Narkose erholt haben (Abbildung 2F).
- Sobald sich die Mäuse von der Narkose erholt haben, stellen Sie den Käfig wieder in das richtige Gestell. Wenn die Mäuse einer Netzhautfunktionsanalyse mittels Elektroretinographie unterzogen werden, sollten die Käfige zur ordnungsgemäßen Anpassung an die Dunkelheit in einen dunklen Raum zurückgebracht werden.
