Quantifizierungsassay für bakterielle Infektionen: Eine Methode zur Quantifizierung der intraokularen bakteriellen Last im Mausmodell der bakteriellen Endophthalmitis

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Vorbereitung des Ernterohrs

1. Geben Sie 1 mm sterile Glasperlen in 1,5 mL Schraubverschlussröhrchen.
2. Sterilisieren Sie diese Röhrchen in einem Autoklaven bei trockener Einstellung. Lassen Sie die Tuben vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen.
3. Geben Sie 10 ml 1x sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
4. Geben Sie 1 Tablette Proteasehemmer-Cocktailtablette in das Röhrchen. Durch Vortexen mischen.
5. Pipettieren Sie 400 μl 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), die einen Proteaseinhibitor enthält, in jedes autoklavierte Ernteröhrchen. Beschriften Sie die Röhrchen und legen Sie sie auf Eis. (Abbildung 1A).

2. Die Augen ernten

1. Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 durch.
2. Euthanasieren Sie die Maus durch Einatmen von CO₂. Verwende eine zweite Methode, um die Sterbehilfe zu bestätigen.
3. Halten Sie den euthanasierten Mauskopf fest und öffnen Sie die Pinzette mit feiner Spitze auf beiden Seiten des infizierten Auges. Drücke nach unten in Richtung Kopf, um das Auge zu stützen. Sobald sich die Zange hinter dem Globus des Auges befindet, drücke die Zange zusammen. Ziehen Sie die Pinzette vom Kopf weg, um den Augapfel zu lösen (Abbildung 1B).
4. Lege den Augapfel sofort in ein beschriftetes Ernteröhrchen. Legen Sie die Röhrchen nicht länger als 60 Minuten auf Eis (Abbildung 1C).

3. Intraokulare Keimzahl

1. Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt unter den Bedingungen der Biosicherheitsstufe 2 durch.
2. Vergewissern Sie sich, dass alle Entnahmeröhrchen fest verschlossen und ausbalanciert sind, während sie sich im Gewebehomogenisator befinden (Abbildung 2A). Schalten Sie den Gewebehomogenisator 1 Minute lang ein, um die Proben zu homogenisieren. Warten Sie 30 s und schalten Sie sich dann für eine weitere Minute ein. Legen Sie die Röhrchen auf Eis (Abbildung 2B,C).
3. Verdünnen Sie jede Probe seriell 10-fach, indem Sie nacheinander 20 μl des Homogenats in 180 μl steriles 1x PBS überführen. Verdünnen, bis ein Faktor von ^10-7 erreicht ist (Abbildung 2D).
4. Beschriften Sie jede Reihe einer warmen, quadratischen BHI-Platte mit den richtigen Verdünnungsfaktoren. Übertragen Sie 10 μl jeder Verdünnung in einer Reihe auf die obere BHI-Platte, die um ca. 45° geneigt ist. Lassen Sie die Probe laufen, bis sie fast den Boden der Platte erreicht, und legen Sie die Platte dann flach hin (Abbildung 2E).
5. Wenn die Probe in den BHI-Agar aufgenommen wurde, wird die Platte in einen 37 °C-Inkubator überführt. Die Bienenvölker sollten 8 Stunden nach dem Einsetzen in den Brutkasten sichtbar sein.
6. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator, bevor das Wachstum der B. cereus-Kolonien die Identifizierung einzelner Kolonien beeinträchtigt (Abbildung 2F).
7. Für eine genaue Darstellung der Konzentration in der Probe zählen Sie die Reihe mit 10 bis 100 Kolonien. Zum Beispiel hat eine Reihe mit der Verdünnungsfraktion von ^10-4 mit 45 Kolonien eine Konzentration von 4,5 x 10⁵ KBE/ml.
8. Um die Gesamtzahl der Bakterien pro Auge zu berechnen, multiplizieren Sie die Konzentration mit 0,4, was dem Millilitervolumen von 1x PBS entspricht, das zur Homogenisierung des Auges verwendet wird. Zum Beispiel würde die Konzentration von 4,5 x 10⁵ KBE/ml 1,8 x 10⁵ KBE B. cereus pro Auge bedeuten.

Abbildung 1: Entnahme eines mit Mäusen infizierten Auges. Nach der Infektion, nach dem gewünschten Zeitpunkt, werden infizierte Mausaugen mit einer sterilen Pinzette entnommen. (A) PBS mit sterilen Glasperlen. (B) Entnahme des infizierten Auges. (C) Entnahmeröhrchen mit einem Mausauge.

Abbildung 2: Aufbereitung des entnommenen Auges für die intraokulare Keimzahl. (A) Entnahmeröhrchen mit infiziertem Auge, das fest an einen Gewebehomogenisator geklemmt ist. (B) Infizierte Augen wurden zweimal für jeweils 1 Minute homogenisiert. Verfolgung der Verdünnung (D) der Augenhomogenate (C) und anschließende Plattierung (E) für die bakterielle Quantifizierung. (E) Repräsentative individuelle Bacillus cereus-Kolonie nach Verdünnung der Spur.