ex vivo Lungenperfusion: Eine Technik für die Lungenforschung im Kaninchenmodell

Zusammenfassung

Quelle: Pacheco-Baltazar, A., et al., Isoliertes Lungenperfusionssystem im Kaninchenmodell. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt eine ex vivo Technik zur isolierten Lungenperfusion. Es ist ein Instrument für die Lungenforschung, das die Untersuchung verschiedener physiologischer und pathologischer Mechanismen bei Lungentransplantationsverfahren unterstützen wird.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Kanülierung:

1. Legen Sie die frisch isolierte Lunge des Kaninchens zusammen mit dem Herzen auf eine sterile Gaze auf eine Petrischale.
2. Um eine Atelektase zu verhindern, beatmung der Lunge mittels Überdruckbeatmung mit positivem endexspiratorischem Druck (PEEP) von 2 cmH₂O.
3. Entfernen Sie die Ventrikel, indem Sie sie auf Höhe der atrioventrikulären Furche vom Herzen abschneiden.
4. Nach dem Öffnen der beiden Ventrikel führen Sie die Lungenarterienkanüle OD 4,6 mm für das Kaninchen mit einem Korb durch die Lungenarterie ein und führen Sie die Kanüle OD 5,9 mm linker Vorhof für das Kaninchen mit dem Korb durch die Mitralklappe in den linken Vorhof ein.
5. Verwenden Sie eine 4-0-Seidennaht in der Lungenarterie und im linken Vorhof, um die Kanülen zu fixieren. Schließen Sie das umgebende Gewebe in die Ligaturen der Lungenarterie und des linken Vorhofs ein, um die Dehnung dieser Strukturen zu vermeiden.
6. Injizieren Sie 250 ml isotonische Kochsalzlösung durch die arteriellen Kanülen, um das restliche Blut aus dem Gefäßbett zu spülen.

2. Perfusionstechnik:

1. Einrichtung:
   1. Legen Sie die isolierte Lunge vorsichtig in die Lungenkammer.
   2. Befestigen Sie die Luftröhre am Transduktor an der Abdeckung der Kammer.
   3. Verbinden Sie die kanülierten Gefäße mit dem Perfusionssystem.
   4. Schließen Sie die Kammer und sichern Sie sie mit dem Drehverschluss.
      Anmerkung: Der rezirkulierende Perfusionskreislauf besteht aus einem offenen venösen Reservoir, einer Peristaltikpumpe, einem Wärmetauscher und einer Blasenfalle.
   5. Setzen Sie an dieser Stelle den Kammerdeckel auf und schalten Sie einen Absperrhahn um, um von Über- auf Unterdruckbelüftung umzuschalten. Um die Unterdruckbeatmung der Lunge und den luftdichten Verschluss der Kammer zu überprüfen, ist die Atemauslenkung der Lunge und der Kammerdruck auf dem Manometer zu überprüfen.
   6. Perfundieren Sie die Lunge mit 200 ml künstlichem blutfreiem Perfusat (einem Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer, der 2,5 % Rinderalbumin enthält).
   7. Beginnen Sie den Perfusatfluss bei 3 ml/min/kg und erhöhen Sie den Fluss dann langsam über einen Zeitraum von 5 Minuten auf 5 ml/min/kg. Erreichen Sie in den nächsten 5 Minuten einen Fluss von 8 ml/min/kg und erreichen Sie nach weiteren 5 Minuten einen maximalen Fluss von 10 ml/min/kg. Achten Sie darauf, dass keine Luft in den Kreislauf gelangt.
      Anmerkung: Halten Sie den pH-Wert und die Temperatur des Perfusats innerhalb physiologischer Bereiche (pH 7,4-7,5; Temperatur, 37 °C-38 °C). Um den pH-Wert einzustellen, fügen Sie NaHCO₃ (1N) hinzu oder erhöhen Sie den Kohlendioxidfluss. Alternativ können Sie HCl (0,1N) zum Ansäuern verwenden.
2. Parameter:
   1. Prüfen Sie, ob die vorgegebenen Perfusions- und Beatmungsparameter wie gewünscht eingestellt sind.
   2. Beatmen Sie die Lunge mit befeuchteter Luft mit einer Frequenz von 30 bpm, einem Atemzugvolumen von 10 ml/kg und einem endexspiratorischen Druck (Pe) von 2 cmH₂O.
      Anmerkung: Der pulmonalarterielle Druck (0-20 mmHg) entspricht der Höhe des Flüssigkeitsspiegels im Oxygenator oder Reservoir in Zentimetern über dem Lungenstamm, während der pulmonalvenöse Druck der Höhe der Druckausgleichskammer über dem linken Vorhof entspricht. Beide Werte können geändert werden. Beachten Sie, dass der Druck des linken Vorhofs ebenfalls 0-20 mmHg beträgt.
3. Erreichen der Bedingungen von Zone 3:
   1. Verwenden Sie die beiden Katheter, die mit den seitlichen Anschlüssen der Kanülen verbunden sind, die in der Lungenarterie, im linken Vorhof befestigt sind, und die Druckwandler, um den arteriellen (Pa) und venösen (Pv) Druck zu messen.
   2. Stellen Sie den Ausgangsdruck auf Höhe des Lungenhilums ein (Null-Referenz).
   3. Die Versuche sind unter den Belüftungsbedingungen der Zone 3 durchzuführen. Um dies zu erreichen, warten Sie 10-15 Minuten, um ein Gleichgewicht zu erreichen, das durch einen isogravimetrischen Zustand gekennzeichnet ist.
   4. Stellen Sie sicher, dass der venöse Druck höher ist als der Alveolardruck (Palv) und der arterielle Druck höher bleibt als beide (Pa > Pv > Palv), damit Zone 3 Bedingungen auftreten.
   5. Stellen Sie sicher, dass das Lungengewicht konstant bleibt und der arterielle und linke Vorhofdruck stabil ist, um die Bedingungen der Zone 3 zu erreichen, um eine maximale Anzahl von Lungengefäßen zu öffnen und den mikrovaskulären Bettinhalt während des Experiments zu erhalten.
      Anmerkung: Bei der Messung von Kfc als Indikator für ein Lungenödem gibt es keine Unterschiede zwischen einem manuellen und einem automatischen Perfusionssystem.
4. Elektronische Steuerung und Signalverarbeitung: Stellen Sie sicher, dass unter anderem der Atemfluss, Gewichtsveränderungen, der mikrovaskuläre Druck, das Atemzugvolumen, der Gefäßwiderstand auf einer mehrfachen zentralen Elektronikeinheit registriert werden, die die von den Schallköpfen kommenden Signale integriert und auf dem Auswertesystem anzeigt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-Stopp Tygon E-Lab Schlauch, 3.17 mm ID, 12/Pack, Schwarz/Weiß	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr. 73-1864
Adapter für Überdruckbeatmung am IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-4312
Adapter für Überdruckbeatmung am IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-4312
Alternative drucklose Gasversorgung für IPL-4: Zur Versorgung der Luftröhre mit einem Gasgemisch, das sich von der Raumluft bei Negativbelüftung unterscheidet	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-4309
Basiseinheit für die isolierte perfundierte Lunge vom Kaninchen zum fötalen Schwein	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-4138
Rinderserum A2:D41Albumin lyophilisiertes Pulver	Sigma	3912	500 g
Calciumchlorid, CaCl2·2H2O.	JT Bäcker	Artikel-Nr.: 10035-04-8
Kryogene Fläschchen	Corning	430659	2 mL
D-Glukose, C6H12O6.	Sigma	Nr. G5767
Differenzial-Niederdruck-Messumformer DLP2.5, Messbereich +- 2,5 cmH2O, HSE-Steckverbinder	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-3882
Differenzdruckmessumformer MPX, Messbereich +- 100 cmH2O, HSE-Stecker	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-0064
Eppendorf Röhren
Ethanol absolute HPLC-Qualität	Caledon
Falken-Röhren			14 mL
Harvard Schlauchpumpe P-230 (komplett mit Steuerkasten und P-230 Motorantrieb)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70-7001
Beheiztes lineares Pneumotachometer mit einem Durchflussbereich von 0 bis 10 l/min	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 59-9349
Heizungsregler für Einzelpneumotachometer 230 VAC, 50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 59-9703
Heparin	Pisa		5000 Benutzeroberfläche
HPLC-Säule (C18 100A 5U)	Alltech	98121213	150 mm x 4,6 mm
Hydrophiler Spritzenvorsatzfilter	Millex	SLLGR04NL	4 mm
IPL-4 Kernsystem für isolierte Kaninchen- bis hin zu fetalen Schweinelungen, 230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-4296
IPL-4 Kernsystem für isolierte Kaninchen- bis hin zu fetalen Schweinelungen, 230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-4296
Ummanteltes Glasreservoir für Pufferlösung, mit Fritte und Schlauch, 6,0 l	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-0322
Lauda thermostatische Umwälzpumpe, Typ E-103, 230 V/50 Hz, 3 l Badvolumen, Temperaturbereich 20 bis 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-0125
Linke Vorhofkanüle für Kaninchen mit Korb, AD 5,9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-4162
Blutdruckmesskopf P75 für PLUGSYS Modul	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-0020
Magnesiumsulfat-Heptahydrat, MgSO4·7H2O	JT Bäcker	Artikel-Nr.: 10034-99-8
Mikrozentrifugen-Röhrchen	Corning	430909
Option zur Steuerung der Unterdruckbelüftung mit Druckregler für IPL-4	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-4298
Neue Zeland Kaninchen
PISABENTAL (Pentobarbital-Natrium)	Pisa	Q-7833-215
PLUGSYS Koffer, Typ 603* 7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-0045
PLUGSYS TCM Zeitzähler-Modul	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
PLUGSYS Wandler-Verstärker-Modul (TAM-A)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-0065
PLUGSYS Wandler-Verstärker-Modul (TAM-D)	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr. 73-1793
PLUGSYS VCM-4R Lüftungssteuergerät mit Druckregler	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Nr. 73-1755
Kaliumchlorid, KCl.	JT Bäcker	3040-01
Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO4	JT Bäcker	Artikel-Nr.: 7778-77-0
Pulmonalarterienkanüle für Kaninchen mit Korb, AD 4,6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-4161
Servoregler für die Perfusion (SCP	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-2806
Mikrozentrifugenröhrchen mit Schnappverschluss	Costar	3620	1,7 mL
Natriumbicarbonat, NaHCO3	Sigma	Nr. S6014
Natriumchlorid, NaCl.	Sigma	Nr. S9888
OP-Handschuhe Nr. 7 1/2
OP-Handschuhe Nr. 8
Taygon Rohre	Masterflex
Trachealkanüle für Kaninchen, AD 5,0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	Tel.: 73-4163

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