Vorbereitung eines bewussten Kaninchenmodells für die simultane Video-EEG-EKG-Oximetrie-Kapnographie für experimentelle Eingriffe: Ein Verfahren zur Implantation von EEE-EKG-Elektroden und Befestigung von Atemsonden im Kaninchenmodell

Zusammenfassung

Quelle: Bosinski, C. et al., Multi-System-Monitoring zur Identifizierung von Krampfanfällen, Arrhythmien und Apnoe bei bewussten zurückgehaltenen Kaninchen. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Implantation von EEG-EKG-Elektroden und zum Anbringen von Atemsonden in einem Kaninchenmodell zur Erfassung und Analyse von Aufzeichnungen seiner Biosignale.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Implantieren von EEG-EKG-Elektroden und Anbringen von Atemmonitoren

1. Nehmen Sie ein Kaninchen aus der Transportbox und legen Sie es auf den Schoß eines sitzenden Untersuchers.
2. Halten Sie das Kaninchen senkrecht und halten Sie es nahe am Körper des Untersuchers.
3. Senken Sie das Kaninchen in eine Rückenlage, wobei der Kopf des Kaninchens auf den Knien des Untersuchers liegt und der Kopf des Kaninchens niedriger ist als der Rest seines Körpers.
   Anmerkung: Dieses Manöver entspannt das Tier und minimiert die Wahrscheinlichkeit, dass es versucht, sich zu bewegen oder zu entkommen, während es die Elektroden platziert.
4. Jetzt, da das Kaninchen in Rückenlage gesichert ist, bitten Sie einen zweiten Untersucher, das Fell zu verteilen, bis die Haut identifiziert und vom darunter liegenden Gewebe isoliert werden kann.
5. Führen Sie 35° gebogene Elektroden subdermal in jede Achselhöhle ein (Abbildung 1A).
   Anmerkung: Die Elektroden sollten so durchgeschoben werden, dass sie sicher in der Haut eingehakt sind, aber nicht in tiefere Strukturen eindringen. Wenn die Elektrode in die Haut ein- und wieder austritt (durch und durch), verringert sich die Wahrscheinlichkeit, dass sich die Elektroden lösen, wenn das Kaninchen in den Rückhalteapparat gelegt wird oder wenn es sich während des Versuchs bewegt (Abbildung 1B). Alle Elektroden werden vor dem Platzieren mit 70% Ethanol sterilisiert.
6. Platzieren Sie Elektroden auf der Brust hinter den rechten und linken Vordergliedmaßen und auf dem Bauch vor der linken Hintergliedmaße. Platzieren Sie eine geerdete Stiftelektrode anterior der rechten hinteren Extremität auf dem Bauch (Abbildung 2A).
7. Sobald alle EKG-Ableitungen richtig platziert sind, bringen Sie das Kaninchen wieder in eine Bauchlage, wobei die Elektroden an einer Seite des Kaninchenbauchs nach oben verlaufen, und bringen Sie das Kaninchen in einen Rückhalteapparat in geeigneter Größe (z. B. 6" x 18" x 6"). Wenn Sie das Kaninchen in den Rückhalteapparat legen, ziehen Sie den losen Draht nach oben, um zu verhindern, dass das Kaninchen die Elektroden mit seinen Beinen herauszieht. Kleben Sie die Drähte an die Seite des Rückhaltesystems, damit sie während des Experiments nicht unter dem Kaninchen eingeklemmt werden (Abbildung 2B).
8. Sichern Sie das Kaninchen in der Rückhaltevorrichtung, indem Sie die Rückhaltevorrichtung um den Hals absenken und verriegeln. Bewegen Sie zusätzlich die Hinterbeine unter dem Tier nach oben und sichern Sie die hintere Rückhaltevorrichtung.
   Anmerkung: Man sollte in der Lage sein, 1-2 Finger in den Raum unter dem Hals zu stecken, um sicherzustellen, dass er nicht zu eng ist. Insbesondere bei Experimenten, bei denen es zu motorischen Bewegungen kommen kann, ist es wichtig, die Rückhalteeinrichtung zu straffen, um Bewegungen, mögliche Wirbelsäulenverletzungen, Gliedmaßenluxationen und die Möglichkeit, die hintere Rückhalteeinrichtung herauszutreten, zu minimieren (Abbildung 2B). Die Kaninchen wurden ~5 Stunden lang im Rückhaltesystem gehalten, ohne dass es zu Problemen im Zusammenhang mit erhöhter Bewegung oder Anzeichen von Dehydrierung kam.
   1. Bei kleinen Kaninchen (z. B. unter 2 Monaten) legen Sie eine Gummierhöhung unter das Tier, um das Kaninchen hochzuheben, wodurch verhindert wird, dass das Kaninchen seinen Hals auf die Unterseite der Kopfstütze legt (Abbildung 2C).
      Anmerkung: Ein plötzlicher Abfall der Atem- und Herzfrequenz kann als Folge eines Nackenimpingements auftreten. Lösen Sie in diesem Fall die Halsfessel und heben Sie den Kopf des Kaninchens an, um die Nackenkompression zu lindern.
   2. Wenn das hintere Rückhaltesystem den Rücken/die Wirbelsäule des Kaninchens nicht genau verfolgt, platzieren Sie einen PVC-Abstandshalter, um Bewegungen zu verhindern, die Wirbelsäulenverletzungen verursachen könnten.
      Anmerkung: Zum Beispiel kann ein PVC-Rohr mit einer Länge von ~14 cm x einem Innendurchmesser von 4 Zoll, bei dem die unteren 25-33 % entfernt sind, mit Schaumstoff über das Kaninchen gelegt werden, um eine angemessene Rückhaltung zu gewährleisten (Abbildung 2C).
9. Nachdem das Kaninchen nun sicher in den Fixierapparat eingesetzt wurde, führen Sie die 7-13 mm großen, subdermalen geraden Stiftelektroden in die Kopfhaut ein (Abbildung 1A). Führen Sie die Drähte mit einem Einführungswinkel von 45° zwischen den Ohren nach oben und binden Sie die Drähte locker an den Rückhalteapparat hinter dem Kopf, um die Platzierung der Leine beizubehalten. Platzieren Sie 5 EEG-Ableitungen in den folgenden Positionen: rechts anterior, links anterior, rechts okzipital, links occipital und eine zentrale Referenzableitung (Cz) an der Stelle zwischen den anderen 4 Ableitungen (Abbildung 2D).
   Anmerkung: Elektroden werden richtig platziert, wenn sie im Unterhautgewebe gegen den Schädel positioniert werden. Diese Platzierung minimiert Artefakte von Nase, Ohren und anderen umgebenden Muskeln. Einige Artefakte durch rhythmische Nasenbewegungen sind unvermeidlich. Die vorderen EEG-Elektroden sollten medial zu den Augen des Kaninchens platziert werden und nach vorne zeigen. Die Hinterhauptelektroden sollten vor den Ohren platziert werden und zeigen in mediale Richtung. Cz wird in der Mitte des oberen Teils des Kopfes an einem Punkt platziert, der sich zwischen allen 4 Elektroden befindet (auf halbem Weg zwischen Lambda und Bregma, entlang der Nahtlinie). Der Stift der Cz-Elektrode zeigt nach vorne.
   1. Führen Sie die EEG-Drähte zwischen den Ohren nach oben, um zu verhindern, dass das Kaninchen versucht, in die Drähte zu beißen.
10. Befestigen Sie den Pulsoximeter-Plethysmographen am Ohr des Kaninchens über der Ohrrandvene.
    Anmerkung: Es kann erforderlich sein, überschüssige Haare aus dem Ohr zu rasieren, um das Signal zu verbessern, oder etwas Gaze zu verwenden, um den Sensor an Ort und Stelle zu halten.
    1. Stellen Sie sicher, dass die Herzfrequenz in der Plethysmographie mit der Herzfrequenz aus dem EKG korreliert und dass die Sauerstoffsättigung angezeigt wird (Abbildung 3C).
11. Legen Sie die Gesichtsmaske vorsichtig mit dem Kapnographieschlauch über Mund und Nase des Kaninchens (Abbildung 2H). Befestigen Sie die Gesichtsmaske mit einer Schnur, die um die Maske gewickelt ist, und befestigen Sie beide Enden der Schnur an der Halterung. Befestigen Sie das andere Ende des Kapnographieschlauchs am Vitalparametermonitor.
    Anmerkung: Es ist wichtig zu verhindern, dass die Schnur während des Experiments über die Augen des Kaninchens gelegt wird. Kleben Sie dazu die Schnur in der Mitte des Gurtes zwischen den Ohren des Kaninchens fest. Um das Kapnographiesignal zu verbessern, erstellen Sie ein Einwegventil mit Klebeband und einem dünnen Stück Nitril, das den Eintritt von Sauerstoff in das T-Stück ermöglicht und das ausgeatmete CO2 in den Kapnographieschlauch leitet (Abbildung 2I).

2. Aufzeichnung des Video-EEG-EKGs

1. Führen Sie eine Video-EEG-EKG-Aufzeichnung mit einer handelsüblichen EEG-Software durch.
   Anmerkung: Die Biopotentialleitungen und das Video sind zeitlich gesperrt, um später die elektrischen und Videosignale zu korrelieren (z. B. EEG-Spitze mit einem myoklonischen Ruck).
2. Bestätigen Sie die optimale Konnektivität ohne Grundliniendrift, ohne elektrisches Rauschen von 60 Hz und mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis. Stellen Sie insbesondere sicher, dass jede Phase der Herzwellenform im EKG sichtbar gemacht werden kann und dass die Delta-, Theta- und Alpha-Wellen nicht durch hochfrequentes Rauschen im EEG verdeckt werden.
   1. Wenn alle Elektroden übermäßiges Rauschen erzeugen, stellen Sie die zentrale Referenzleitung ein. Wenn nur eine Elektrode übermäßig laut ist, schieben Sie diese Elektrode tiefer in die Haut oder positionieren Sie sie neu, bis kein Metall mehr freiliegt.
3. Passen Sie das Video so an, dass alle Kaninchen gleichzeitig zu sehen sind, was die Korrelation der motorischen Aktivität mit den EEG-Befunden ermöglicht (Abbildung 3A).
   Anmerkung: Das System ermöglicht gleichzeitige EEG-/EKG-/Oximetrie-/Kapnographie-Aufzeichnungen von bis zu 7 Kaninchen.
4. Beginnen Sie die Basisaufzeichnung von jedem Tier für mindestens 10-20 Minuten oder bis sich die Herzfrequenz auf einen ruhigen, entspannten Zustand (200-250 Schläge pro Minute) stabilisiert hat und die Kaninchen mindestens 5 Minuten lang keine großen Bewegungen zeigen. Erfassen Sie elektrografische Daten mit voller Bandbreite ohne Filter. Zur besseren Visualisierung den Tieftonfilter (=Hochpassfilter) auf 1 Hz und den Hochfrequenzfilter (=Tiefpassfilter) auf 59 Hz einstellen.
   Anmerkung: Ein weiteres Zeichen dafür, dass das Kaninchen entspannt ist, ist das Einsetzen von EEG-Schlafspindeln (auf die später eingegangen wird).
5. Fügen Sie während des Experiments in Echtzeit zeitlich fixierte Notizen hinzu, um den Zeitpunkt von Interventionen (z. B. Medikamentenverabreichung) und neurokardialen Ereignissen (z. B. EEG-Spitze, motorische Anfälle, ektopischer Schlag und Arrhythmien) sowie motorische/untersucherspezifische Artefakte anzuzeigen
   Anmerkung: Aufgrund der Häufigkeit, mit der der Untersucher eine Intervention vornehmen muss (z. B. photische Stimulation, Wirkstoffabgabe), um den Stress eines Untersuchers beim Betreten und Verlassen des Raumes und beim Öffnen/Schließen der Tür zu minimieren, bleibt der Untersucher während des gesamten Experiments auf der gegenüberliegenden Seite des Raumes. Der Untersucher sitzt so weit wie möglich vom Tier entfernt und bleibt ruhig und ruhig, um eine mögliche Störung der Tiere zu minimieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Bild der EEG- und EKG-Elektroden. (A) Gebogene EKG-Elektroden und gerade EEG-Elektroden. (B) Wie man die EKG-Elektrode in das Unterhautgewebe des Kaninchens einhängt, so dass sie durch und durch ist. Abkürzungen (LL: Linke Extremität, RA: Rechter Arm, RL: Rechte Extremität, LA: Linker Arm, RF: Rechts frontal, LF: Links frontal, Cz: Mitte, RO: Rechtes ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Computer	Tal	Optiplex 5040	Erfassungs-Computer
EKG-Elektrode	RhythmusLink	RLSND116-2,5	13 mm 35 Grad gebogene (0,4 mm Durchmesser) subdermale Stiftelektroden
EEG-Elektrode	RhythmusLink	RLSP513	5-Twist 13 mm gerade (0,4 mm Durchmesser) subdermale Stiftelektroden
EEGLAB (2020)	Swartz Zentrum für Computational Neuroscience	freier Zugang	Kann eine spektrale Analyse des EEGs durchführen
Ethernet-zu-Ethernet-Adapter	Linksys (Englisch)	USB3G16	Adapter zum Anschluss der Kamera an den Computer
Schaumstoff-Polsterung	generisch	N/A	Reduziert den Druck, der durch den Rückhalteapparat auf den Hals kleiner Kaninchen ausgeübt wird, um die nachteiligen kardiorespiratorischen Auswirkungen der Nackenkompression zu verhindern
MATLAB (R2019b, Aktualisierung 5)	MathWorks (Englisch)	N/A	Erforderlich für die Ausführung von EEGLAB
Mikrofon	Sony Stereoanlage	ECM-D570P	Aufzeichnung von hörbaren Manifestationen von Anfällen
Mikroporen-Klebeband, Papier, Weiß	3M	Nr. 1530-1	Wird verwendet, um Drähte zu sichern und Ohrschienen herzustellen
Natus NeuroWorks	Natus	LC101-8	Akquisitions- und Überprüfungssoftware
Photischer Stimulator	Gras	PS22	Stimulator zur Steuerung von Frequenz, Verzögerung, Dauer, Intensität der Lichtimpulse
Kunststoff-Draht-Organizer / Bündler	12Vwire.com	LM-12-100-BLK	Bündeln Sie Drähte, um den Lärm zu reduzieren
PS 22 Photischer Stimulator	Gras-Instrumente	BZA641035	Stroboskoplicht mit einstellbarer Blitzfrequenz, Verzögerung und Intensität
PVC-Rohr	generisch	N/A	Verhindert, dass kleine Kaninchen mit den Hinterbeinen treten und Wirbelsäulenverletzungen verursachen
Kaninchen Zurückhaltung	Plas-Labs	501-TC	Kaninchen-Rückhaltesysteme in verschiedenen Größen sind erhältlich. 6" x 18" x 6" in dieser Studie.
Gummiauflage (Booster)	generisch	N/A	Hebt kleine Kaninchen im Rückhaltesystem hoch, um eine Kompression des Halses zu verhindern
SpO2 Ohrclip	NONIN	61000	PureSAT/SpO2
SpO2 Sensor-Adapter	NONIN	Artikel-Nr.: 13931	XPOD PureSAT/SpO2
Webcol Alcohol Prep, steril, groß, 2-lagig	Covidien	5110	Zur Vorbereitung der Ohrvene vor der Katheterisierung
LabChart Pro (2019, Version 8.1.16)	ADInstruments	N/A	EKG-Analyse
Quanten-Verstärker	Natus	Artikel-Nr.: 13926	Verstärker / Digitalisierer
Quantum HeadBox Verstärker	Natus	Artikel-Nr.: 22134	64-polige Breakout-Box
SRG-X120 1080p PTZ-Kamera mit HDMI-, IP- und 3G-SDI-Ausgang	Sony	SRG-X120	Impela Kamera