Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
Neuseeländische weiße Kaninchen wurden durch eine Überdosis Pentobarbital (150 mg/kg) verdünnt in 0,9% NaCl, intraperitoneal injiziert, euthanasiert und die Augen wurden unmittelbar nach der Tötung enukleiert.
1. Vor der Vorbereitung
- Bereiten Sie das komplette Medium vor (DMEM/Schinken F12, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 80 μg/ml Penicillin / 80 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B). Erhitzen Sie das Medium, 1x PBS und 0,25 % Trypsin (falls erforderlich) in einem 37 °C warmen Wasserbad.
- Legen Sie ein steriles Tuch in die Haube, um einen aseptischen Arbeitsplatz vorzubereiten. Führen Sie alle benötigten sterilen Instrumente und Materialien in die Haube ein.
Anmerkung: Nur die Enukleation der Augen und die Reinigung von verbleibendem Muskelgewebe und Haut sind die Eingriffe, die außerhalb der Haube durchgeführt werden, der Rest der Schritte muss innerhalb der Haube durchgeführt werden.
2. Isolierung von PE-Zellen aus Kaninchen
- Verwenden Sie eine gebogene Schere und eine Colibri-Pinzette, um die Augen nach dem Einschläfern des Tieres zu enukleieren. Reinigen Sie die Augen von restlichem Muskelgewebe und Haut mit Schere und Pinzette (unsteril).
Anmerkung: Die Größe der Schere und Pinzette, die für die Enukleation und Reinigung der Augen verwendet werden, hängt von der Spezies ab (z. B. sind die Instrumente für Ratte und Maus kleiner als für Schweine und Rinder) (siehe Abbildung 1).
- Sammeln Sie die Augen in einem 50-ml-Röhrchen, das mit unsterilem PBS gefüllt ist, und übertragen Sie das Röhrchen in die Laminar-Flow-Haube. Desinfizieren Sie die Augen, indem Sie sie 2 Minuten lang in eine Lösung auf Jodbasis tauchen und dann in eine mit sterilem PBS gefüllte Petrischale geben.
- Öffnen der Glühbirne
- Legen Sie ein Auge auf einen sterilen Mullwickel und halten Sie ihn fest am Sehnerv. Öffne das Auge mit dem Skalpell #11 und einer Schere ca. 2 mm unter dem Limbus. Entferne den vorderen Augenabschnitt (Hornhaut, Linse und Iris) und lege ihn in eine Petrischale. Lassen Sie die Zwiebel mit dem Glaskörper, bis die RPE-Zellen isoliert sind.
- Isolierung von IPE-Zellen
- Entfernen Sie die Linse und ziehen Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig die Iris heraus, die die IPE-Zellen enthält. Legen Sie die Iris in eine Petrischale, waschen Sie sie mit sterilem PBS und lassen Sie sie in PBS, bis weitere Iris vorbereitet sind. Entfernen Sie den Ziliarkörper von der Iris, indem Sie mit einem Skalpell #10 schneiden.
- Nach der Präparation von 2 Iris mit 1 ml 0,25% Trypsin bei 37 °C für 10 min inkubieren; während dieser Zeit können die RPE-Zellen isoliert werden (siehe Schritt 2.4). Entfernen Sie das Trypsin und geben Sie 1 ml vollständiges Medium in die Iris und isolieren Sie die Zellen, indem Sie sie vorsichtig mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette zerkratzen. Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig durch Pipettieren und überführen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen. Nehmen Sie 10 μL der Zellsuspension und verdünnen Sie sie 1:3 mit Trypanblau, um die Zellen in der Neubauer-Kammer zu zählen.
- Wenn nicht sofort transfiziert, säen Sie 200.000 Zellen/Well in einer 24-Well-Platte (100.000 Zellen/cm2) in 1 ml vollständigem Medium (10 % FBS) (zur Aussaat siehe Tabelle 1). Stellen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 °C, 5 % CO2,
Anmerkung: Es könnte notwendig sein, mehrere Augen zusammenzufassen, um genügend Zellen für die Aussaat zu haben.
- Isolierung von RPE-Zellen
- Glaskörper und Netzhaut mit einer dünnen Pinzette aus dem hinteren Augenabschnitt entfernen. Vermeiden Sie eine Beschädigung des retinalen Pigmentepithels.
- Lege eine sterile Gaze in eine 12-Well-Platte und lege die Zwiebel über die Gaze.
- Mit PBS waschen. 50 μl 0,25 % Trypsin pro Auge zugeben und 10 Minuten bei 37 °C inkubieren. Trypsin entfernen und 150 μl vollständiges Medium pro Globus hinzufügen und die RPE-Zellen vorsichtig mit einer gebogenen, feuerpolierten Pasteur-Pipette abkratzen; Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Gewebe zu immobilisieren. Sammeln Sie die Zellsuspension und geben Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen. Nehmen Sie 10 μl der Zellsuspension; 1:4 mit Trypanblau verdünnen, um die Zellen in der Neubauer-Kammer zu zählen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen 10 min bei 120 x g.
- Wenn nicht sofort transfiziert, säen Sie 200.000 Zellen/Well in einer 24-Well-Platte (100.000 Zellen/cm2) in 1 ml vollständigem Medium (10 % FBS) (zur Aussaat siehe Tabelle 1). Stellen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 °C, 5 % CO2,
Anmerkung: Es könnte notwendig sein, mehrere Augen zusammenzufassen, um genügend Zellen für die Aussaat zu haben.