Isolierung von IPE- und RPE-Zellen: Eine Technik zur Gewinnung pigmentierter Epithelzellen aus isoliertem Schweineauge

Zusammenfassung

Quelle: Bascuas T. et al., Isolierung, Kultur und Gentechnik von primären Pigmentepithelzellen von Säugetieren für die nicht-virale Gentherapie. J. Vis. Exp. (2021).

In diesem Video beschreiben wir eine Technik zur Isolierung von Iris- und retinalen Pigmentepithelzellen aus Schweineaugen, um ihre Primärkulturen für in vivo und ex vivo Studien zu erhalten. Diese Pigmentzellen könnten genetisch verändert werden, um regenerative Ansätze zur Behandlung von Augenerkrankungen zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Vor der Vorbereitung

1. Bereiten Sie das komplette Medium vor (DMEM/Schinken F12, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 80 μg/ml Penicillin / 80 μg/ml Streptomycin und 2,5 μg/ml Amphotericin B). Erhitzen Sie das Medium, 1x PBS und 0,25 % Trypsin (falls erforderlich) in einem 37 °C warmen Wasserbad.
2. Legen Sie ein steriles Tuch in die Haube, um einen aseptischen Arbeitsplatz vorzubereiten. Führen Sie alle benötigten sterilen Instrumente und Materialien in die Haube ein.
   HINWEIS: Nur die Enukleation der Augen und die Reinigung von verbleibendem Muskelgewebe und Haut sind die Verfahren, die außerhalb der Haube durchgeführt werden, die restlichen Schritte müssen innerhalb der Haube durchgeführt werden.
3. Schweineaugen wurden innerhalb von 6 Stunden nach der Tötung aus einem örtlichen Schlachthof gewonnen und auf Eis ins Labor transportiert

2. Isolierung von PE-Zellen von Schweinen

1. Verwenden Sie eine gebogene Schere und eine Colibri-Pinzette, um die Augen nach dem Einschläfern des Tieres zu enukleieren. Reinigen Sie die Augen von restlichem Muskelgewebe und Haut mit Schere und Pinzette (unsteril).
   Anmerkung: Die Größe der Schere und Pinzette, die für die Enukleation und Reinigung der Augen verwendet werden, hängt von der Spezies ab (z. B. sind die Instrumente für Ratte und Maus kleiner als für Schweine und Rinder) (siehe Abbildung 1).
   1. Sammeln Sie die Augen in einem 50-ml-Röhrchen, das mit unsterilem PBS gefüllt ist, und übertragen Sie das Röhrchen in die Laminar-Flow-Haube. Desinfizieren Sie die Augen, indem Sie sie 2 Minuten lang in eine Lösung auf Jodbasis tauchen und dann in eine mit sterilem PBS gefüllte Petrischale geben.
   2. Nachdem Sie die Augen in eine sterile Petrischale übertragen haben, halten Sie eine mit einer Colibri oder einer spitzen Pinzette fest an den Sehnerv. Mit einer 18 G Nadel ein Loch in die Nähe der Grenze der Iris (zwischen Pars plana und Ora serrata) stechen. Führen Sie eine kleine Schere in das Loch ein und schneiden Sie um die Iris herum. Entferne den vorderen Augenabschnitt (Hornhaut, Linse und Iris) und lege ihn in eine Petrischale. Lassen Sie die Zwiebel mit dem Glaskörper, bis die RPE-Zellen isoliert sind.

3. Isolierung von IPE-Zellen

1. Entfernen Sie den Ziliarkörper von der Iris, indem Sie mit einem Skalpell #10 schneiden. Nach der Vorbereitung von 2 Iris 1 ml vollständiges Medium hinzufügen und die Zellen durch vorsichtiges Kratzen mit einer flachen, feuerpolierten Pasteurpipette isolieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen. Nehmen Sie 10 μl der Zellsuspension und verdünnen Sie sie 1:4 mit Trypanblau, um die Zellen in der Neubauer-Kammer zu zählen.
2. Wenn nicht sofort transfiziert, säen Sie 200.000 Zellen/Well in einer 24-Well-Platte (100.000 Zellen/^cm2) in 1 ml vollständigem Medium (10 % FBS) (zur Aussaat siehe Tabelle 1). Stellen Sie die Platte in einen Inkubator und kultivieren Sie sie bei 37 °C, 5 % CO₂,
   Anmerkung: Es könnte notwendig sein, mehrere Augen zusammenzufassen, um genügend Zellen für die Aussaat zu haben.

4. Isolierung von RPE-Zellen

1. Führen Sie Schritt 1.1.1 aus. Legen Sie die Knolle in eine Petrischale und waschen Sie sie mit PBS. Füllen Sie die Glühbirne mit 1 mL Vollmedium.
2. Entfernen Sie mit einer gebogenen, feuerpolierten Pasteur-Pipette vorsichtig die RPE-Zellen. Achten Sie darauf, von unten nach oben zu kratzen, um ein Abrutschen des Aderhaut-Bruch-Membrankomplexes zu vermeiden. Sammeln Sie die Zellsuspension mit einer 1.000-μl-Pipette im Kolben und geben Sie sie zur Resuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen. Nehmen Sie 10 μl der Zellsuspension und verdünnen Sie sie 1:8 mit Trypanblau, um die Zellen in der Neubauer-Kammer zu zählen.
3. Samenzellen wie in Schritt 3.2 beschrieben.

Ergebnisse

Spezies	Behandlung mit Trypsin	Anzahl der IPE-Zellen	N° RPE-Zellen	Platte für die Aussaat (100.000 Zellen/cm2)
Schwein	Nein	~1.000.000	~3.000.000	24-Well-Platten

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12-Well-Platten	Corning	353043
24-Well-Platten	Corning	353047
Betadin	Mundipharma
Bonn Mikrozange flach
Colibri Pinzette (steril)
F12 von DMEM/HAM	Sigma-Aldrich	Nr. D8062
FBS	Brunschwig	Tel. P40-37500
Pinzetten (verschiedene Größen) (steril)
NaCl (0,9 %)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Nadel (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neubauer-Kammer	Marienfeld-Superior	Artikel-Nr.: 640010
Pasteur-Pipette (feuerpoliert)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	Nr. D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	Nr. P0781-100
Petrischale	ThermoFisher Scientific	150288
Scarpel Nr. 10	Swann-Morton	Nr. 501
Scarpel Nr. 11	Swann-Morton	Nr. 503
Scharf-scharfe Spitze gebogene extra feine Bonn Schere (steril)
Scharf-scharfe Spitze gerade Extra Fine Bonn Schere (steril)
Tali Bildbasiertes Zytometer	ThermoFisher Scientific	Nr. T10796
Trypsin 0,25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Trypsin 5 % / EDTA 2 %	Sigma-Aldrich	Nr. T4174
Vannas Federschere gebogen (steril)