Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Sterilisation
- KRITISCHER SCHRITT: Desinfizieren Sie alle Pinzetten und Scheren, indem Sie sie 1 h lang in 5%iger (v/v) Distel-Lösung in destilliertem Wasser einweichen, mit einer Bürste reinigen, mit Leitungswasser abspülen und mindestens 2 Stunden lang im Ofen bei 185 °C sterilisieren.
- Alle anderen Glaswaren und Reagenzien durch Autoklavieren bei 121 °C für 15 Minuten sterilisieren oder Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereiten. Führen Sie die folgenden Verfahren in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II durch.
2. Probenentnahme
- Sammlung von Schweineaugen
- Große weiße Landrassensauen, eine Kreuzung mit einem Hampshire-Eber wurde verwendet. Die Tiere wurden mit elektrischem Strom betäubt und die Augen 2 h später im Schlachthof enukleiert.
- KRITISCHER SCHRITT: Nach der Enukleation werden die Augen in einer sterilen phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) ins Labor gebracht, um ein Austrocknen zu verhindern, und sofort nach der Ankunft verarbeitet.
3. Vorbereitung des Hornhautknopfes
- Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um das Gewebe um den Augapfel herum zu halten, und übertragen Sie es in eine Petrischale. Entfernen Sie die Bindehaut und das Muskelgewebe um den Augapfel herum auf einer Petrischale mit der Skalpellklinge Nr. 15 und einer Pinzette.
- Heben Sie den Augapfel vorsichtig an, halten Sie den Sehnerv mit einer Pinzette fest und geben Sie ihn in ein 0,5-Liter-Glas, das mit sterilem PBS gefüllt ist.
- Sobald alle Augen vom umgebenden Gewebe befreit sind, bewegen Sie sie mit einer sterilen Pinzette in ein weiteres 0,5-Liter-Glas, das mit 3% (v/v) Povidon-Jod in PBS gefüllt ist, und lassen Sie es 1 Minute einwirken.
- Übertragen Sie die Augäpfel in ein anderes 0,5-Liter-Glas mit sterilem PBS.
- Halten Sie das Auge mit einer Pinzette auf einer Petrischale ruhig und machen Sie mit einer Skalpellklinge Nr. 10A einen Schnitt in der Nähe der Hornhaut.
- KRITISCHER SCHRITT: Halten Sie die Kante des Schnitts fest und schneiden Sie die Hornhaut mit einer Schere heraus, so dass etwa 3 mm Sklera um die Hornhaut herum übrig bleiben. Stellen Sie sicher, dass das scharfe Ende der Schere nicht die Iris oder das Aderhautgewebe durchbohrt und sich im suprachoroidalen Raum befindet.
- Halten Sie den Korneoskleralknopf mit einer Pinzette fest und verwenden Sie eine weitere Pinzette mit spitzem Ende, um das Aderhautgewebe vorsichtig zu trennen.
- Heben Sie den Korneoskleralknopf vom restlichen Globus an und spülen Sie ihn kurz in 1,5%iger (v/v) Povidon-Jodlösung in PBS in einer 12-Well-Platte.
- Setzen Sie den Korneoskleralknopf in eine weitere 12-Well-Platte ein, die mit sterilem PBS gefüllt ist.
