Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft
1. Vorbereitung eines Inokulums
- 10 ml LB-Brühe werden in einen 50-ml-Erlenmeyerkolben mit Schaumstoffstopfen gegossen
.
- Eine Kolonie von P. aeruginosa Stamm PAO1 oder Stamm PA14 wird von einer frischen Agarplatte übertragen und bei 37 °C für 3-4 h inkubiert, bis sich die Bakterien in der Mitte der logarithmischen Phase befinden.
- Übertragen Sie die Bakterienkultur in ein 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 3.000 x g. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Zellpellet wieder in PBS.
- Wiederholen Sie Schritt 1.3 noch zwei weitere Male, um die Zellen zu waschen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in PBS und stellen Sie die optische Dichte bei 600 nm auf ca. 0,6 ein, indem Sie steriles PBS als Rohling verwenden.
2. Infizieren des Hornhautknopfes
- Nehmen Sie das Medium aus der Petrischale und spülen Sie die Hornhaut zweimal mit 1 mL sterilem PBS aus.
- Drücken Sie die Pinzette sanft zusammen, während Sie die Hornhaut dazwischen halten. Verwenden Sie ein 10A-Skalpell, um vier Schnitte – zwei vertikale, zwei horizontale – im mittleren Abschnitt des Korneoskleralknopfes durch die Epithelschicht zum darunter liegenden Stroma zu machen.
- Legen Sie eine sterile Glasform mit dem breiten Teil nach oben in eine 6-Well-Platte und platzieren Sie die Hornhaut mit der Epithelseite nach unten in der Mitte der Glasform. Machen Sie den Schnitt genau in der Mitte des unteren Teils der Glasform.
- KRITISCHER SCHRITT: Gießen Sie 1 ml 1 ml (w/v) in DMEM gelösten Agar mit niedrigem Schmelzpunkt, um die Glasform vollständig mit Hornhaut zu füllen.
- Lassen Sie den Agar fest werden und drehen Sie dann die Glasform um, so dass das Hornhautepithel nach oben zeigt.
- Pipettieren Sie 15 μl der Bakterienkultur mit OD600 nm = 0,6 (für P. aeruginosa entspricht dies etwa 1 x 107 koloniebildenden Einheiten (KBE) in 15 μl) direkt in einen Schnittbereich und fügen Sie dann 85 μl PBS nach oben hinzu, um das Hornhautepithel feucht zu halten. Verdünnen Sie die restliche Bakterienkultur und die Platte auf Agar, um die koloniebildenden Einheiten für das Inokulum zu zählen.
- Geben Sie 1 ml DMEM ohne Antibiotika mit der Glasform auf den Boden jeder Vertiefung. Die 6-Well-Platte mit den infizierten Hornhautknöpfen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO2 für bis zu 24 h inkubieren.
- Richten Sie neben jedem Experiment eine nicht infizierte Kontrollhornhaut ein. Um eine nicht infizierte Kontrolle einzurichten, ersetzen Sie die 15 μl der Bakterienkultur in Schritt 2.6 durch steriles PBS.
