Ex-vivo-Lungenmodell von Schweinen: Eine Technik zur Entwicklung eines Lungenmodells zur Untersuchung bakterieller Biofilme auf bronchiolärem Gewebe von Schweinen

Zusammenfassung

Quelle: Harrington, N.E. et al., Antibiotika-Wirksamkeitsprüfung in einem Ex-vivo-Modell von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus Biofilmen in der Mukoviszidose-Lunge. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur Entwicklung eines ex vivo Schweinelungenmodells für bakteriellen Biofilm auf infiziertem bronchiolärem Gewebe. Biofilme sind bakterielle Aggregate, die in eine Matrix eingebettet sind, die an einer Oberfläche haftet. Dieses Modell wird verwendet, um die Antibiotika-Empfindlichkeit von Bakterien in verschiedenen Stadien der Biofilmbildung zu untersuchen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Dissektion und Infektion von ex vivo Schweinelungengewebe (EVPL)

1. Stellen Sie SCFM für die Verwendung mit EVPL-Gewebe her, befolgen Sie das Rezept für 1 l modifiziertes SCFM in Tabelle 1.
2. Bereiten Sie vor der Dissektion eine Agarplatte(n) mit den für die Infektion erforderlichen Bakterienstämmen vor, wobei Sie den im Labor üblichen Agar für P. aeruginosa/S. aureus verwenden (z. B. Lysogenbrühe + 1,2 % Agar).
3. Berechnen Sie, wie viele bronchioläre Gewebestücke des Schweins für das Experiment benötigt werden, einschließlich nicht infizierter Kontrollgewebestücke. Multiplizieren Sie diese Zahl mit zwei, um das Experiment in zwei replizierten Lungen zu wiederholen und die Wiederholbarkeit der Ergebnisse zu bestätigen.
4. Multiplizieren Sie die Gesamtzahl der erforderlichen Gewebestücke mit 0,5, um das Volumen an SCFM-Agarose (ml) zu bestimmen, das zur Herstellung von Agarose-Pads benötigt wird, um genügend Medium für 400 μl/Gewebestück zuzüglich Ersatz-SCFM-Agar zu erhalten, um Pipettierfehler oder Verdunstung während der Vorbereitung zu berücksichtigen.
5. Fügen Sie 0,12 g Agarose zu jeweils 15 ml SCFM hinzu, die erforderlich sind, um das gewünschte Gesamtvolumen von SCFM mit 0,8 % Gewichts-/Volumen-Agarose zu erhalten.
6. Erhitzen Sie die SCFM-Agaroselösung, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Eine Haushaltsmikrowelle mit geringer Leistung wird empfohlen. Der Zeitaufwand hängt von der Wattzahl der Mikrowelle ab. Lassen Sie die Agarose auf ca. 50 °C abkühlen (fühlt sich warm an, liegt aber angenehm in der Hand). Nicht weiter abkühlen lassen.
7. Geben Sie mit einer Pipette 400 μl SCFM-Agarose in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte pro benötigtem Gewebestück.
8. Sterilisieren Sie die SCFM-Agarose-haltige 24-Well-Platte/n 10 Minuten lang unter ultraviolettem Licht.
9. Bereiten Sie für jede intakte Lunge, die präpariert wird, drei Wiederholungswaschungen vor, wobei Sie 20 ml steriles Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) plus 20 ml steriles Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, ergänzt mit 50 μg/ml Ampicillin, verwenden.
10. Machen Sie ein Aliquot von 40 mL SCFM als abschließende Spülung für jede intakte Lunge, die präpariert wird. Alle Waschmittel können über Nacht bei 4 °C gelagert oder sofort verwendet werden.
11. Die Lungen so bald wie möglich nach der Schlachtung von der angegebenen Quelle beziehen und sicherstellen, dass sie kalt bleiben, indem sie in einer Haushaltskühlbox zum Labor transportiert werden.
    Anmerkung: Lungen, die näher am Schlachttag liegen, weisen weniger Blutergüsse durch die Lagerung auf, aber Gewebe, das bis zu 4 Tage nach der Schlachtung kühl gelagert wird, kann ebenfalls verwendet werden. Da die Kühlbox in die Metzgerei oder den Schlachthof gebracht werden muss, muss sie nach jedem Gebrauch gemäß den örtlichen Laborrichtlinien dekontaminiert und bei Nichtgebrauch außerhalb des mikrobiologischen Labors gelagert werden, um das Risiko einer Kontamination und eines Durchbruchs des Containments zu verringern.
12. Legen Sie die Lunge auf einer sterilisierten Oberfläche und unter einer Flamme auf ein sauberes Plastikschneidebrett, das mit autoklavierter Aluminiumfolie bedeckt ist. Vergewissern Sie sich, dass die Bronchiolen intakt bleiben. Wenn es im Schlachthof oder während des Transports zu Schäden gekommen ist, ist die Lunge nicht für den Einsatz geeignet.
13. Erhitzen Sie ein Spachtel unter einer Flamme und berühren Sie das Messer ganz kurz mit dem Bereich der Lunge, der die Bronchiolen umgibt, um die Oberfläche des Gewebes zu sterilisieren.
14. Schneiden Sie das Oberflächengewebe, das die Bronchiolen umgibt, mit einer sterilen Rasierklinge ab. Machen Sie Schnitte parallel zu den Bronchiolen, um Schäden zu vermeiden.
15. Sobald die Bronchiolen freigelegt wurden, machen Sie einen Querschnittsschnitt durch die Bronchiole an der höchsten sichtbaren Stelle, um die Bronchiolen zu befreien.
16. Halten Sie das freie Ende der Bronchiole mit einer sterilen Pinzette leicht fest und schneiden Sie mit einer sterilen Rasierklinge das restliche unerwünschte Gewebe ab. Machen Sie einen letzten Querschnittsschnitt über die Bronchiolen, bevor eine Verzweigung sichtbar ist, um die Bronchiole aus der Lunge zu entfernen.
17. Legen Sie die Bronchiolen in die erste Wäsche mit DMEM/RPMI 1640. Lassen Sie die Bronchiolen in der Wäsche und wiederholen Sie die Schritte 1.12 bis 1.15, um weitere Bronchiolenschnitte aus derselben Lunge zu entnehmen, die erforderlich sind, um genügend Gewebeschnitte für den geplanten Versuch zu erhalten.
18. Legen Sie alle zusätzlichen bronchiolären Abschnitte aus derselben Lunge in die Wäsche (Schritt 1.17). Mindestens 2 Minuten in der Wäsche lassen.
19. Entfernen Sie die Bronchiolen aus der ersten Wäsche mit DMEM/RPMI 1640 und geben Sie die Proben in eine sterile Petrischale.
20. Halten Sie jede Bronchiole mit einer sterilen Pinzette leicht fest und achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu beschädigen. Entfernen Sie so viel restliches Weichgewebe wie möglich und schneiden Sie das Gewebe mit einer sterilen Dissektionschere in ~5 mm breite Streifen.
21. Legen Sie alle bronchiolären Gewebestreifen in die zweite Wäsche DMEM/RPMI 1640. Mindestens 2 Minuten in der Wäsche lassen.
22. Entfernen Sie die Gewebestreifen aus der zweiten Wäsche mit einer sterilen Pinzette und achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu beschädigen. Lege das Taschentuch in eine saubere, sterile Petrischale.
23. Entfernen Sie das restliche Weichgewebe, das an den Bronchiolen haftet, und schneiden Sie die Streifen mit einer sterilen Dissektionschere in Quadrate (~5 mm x 5 mm).
24. Geben Sie die dritte Wäsche DMEM/RPMI 1640 in die Petrischale. Mischen Sie die Taschentücher leicht in der Wäsche, indem Sie die Schüssel schwenken.
25. Gießen Sie die dritte Wäsche aus der Petrischale, ohne die Gewebestücke zu entfernen.
26. Geben Sie die abschließende SCFM-Wäsche in die gewebehaltige Petrischale, wobei Sie darauf achten, dass alle Gewebestücke bedeckt sind.
27. Sterilisieren Sie die Gewebestücke in SCFM unter UV-Licht für 5 min.
28. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um jedes sterilisierte bronchioläre Gewebestück in einzelne Vertiefungen einer 24-Well-Platte(n) zu übertragen, die SCFM-Agarose-Pads enthält.
29. Um jedes Gewebestück mit dem gewünschten Bakterienstamm zu infizieren, berühren Sie eine auf einer Agarplatte gewachsene Kolonie mit der Spitze einer 29-g-Nadel, die an einer sterilen 0,5-ml-Insulinspritze befestigt ist. Berühren Sie dann die Kolonie auf dem Gewebestück und stechen Sie vorsichtig in die Gewebeoberfläche.
    Anmerkung: Die Verwendung einer Insulinspritze, die mit einer 29-G-Nadel ausgestattet ist, ermöglicht es, die Nadel genau und bequem zu halten, während die Finger einen sicheren Abstand zur Nadel und zum Lungengewebe halten. Es ist möglich, diesen Schritt mit 29-G-Nadeln durchzuführen, die nicht an einer Spritze befestigt sind, aber dies erfordert eine höhere Geschicklichkeit und erhöht das Risiko einer Nadelstichverletzung. Insulinspritzen sind leicht erhältlich.
30. Bei den nicht infizierten Kontrollen stechen Sie vorsichtig mit der Spitze einer 29-g-Nadel, die an einer sterilen 0,5-ml-Insulinspritze befestigt ist, in die Oberfläche jedes Gewebestücks.
31. Geben Sie mit einer Pipette 500 μl SCFM in jede Vertiefung
.
32. Sterilisieren Sie eine atmungsaktive Dichtungsmembran für jede 24-Well-Platte 10 Minuten lang unter ultraviolettem Licht (Materialtabelle).
33. Entfernen Sie den/die Deckel/die Deckel von der/den 24-Well-Platte(n) und ersetzen Sie sie durch die atmungsaktive Membran.
34. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für die gewünschte Inkubationszeit (Infektionszeit) ohne Schütteln. Prüfen, ob auf den nicht infizierten Kontrollstücken kein sichtbares Wachstum des inokulierten Erregers vorhanden ist (Kontaminationskontrolle).
    Anmerkung: Falls gewünscht, kann Ampicillin zu den SCFM-Agarose-Pads und der SCFM-Abdeckung in Schritt 1.31 bis zu einer Endkonzentration von 20 μg/ml zugesetzt werden. Dies unterdrückt das Wachstum der meisten endogenen Bakterien in der Lunge, ohne das Wachstum von P. aeruginosa oder S. aureus zu beeinträchtigen, aber da das Vorhandensein von Ampicillin die Anfälligkeit für andere Antibiotika beeinflussen kann, muss der Leser diese Wahl abhängig von den Stämmen und Antibiotika treffen, die er testen möchte.

TABELLE 1

>1. Herstellung von synthetischen CF-Sputummedien (SCFM) zur Verwendung mit ex vivo Schweinelungenmodellen

Nach der Herstellung sollte das SCFM filtersterilisiert werden und kann dann bis zu einem Monat bei 4°C gelagert werden.

kg kg . wurden kg . Uhr . kg kg . kg Uhr . kg . kg . Uhr kg

a) Hauptrezept
Schritt 1	chemisch	Menge	Anweisungen	Endgültige mM in 1L SCFM
	NaCl	3,03 Gramm	Salze und Wasser in die Reinigungsflasche geben, nur für die Zubereitung von SCFM verwendet	51,85
	Kcl	ca. 1.114 g		14,94
	dH2O	640 ml		N/A
Schritt 2	chemisch	Feuchtigkeit von in Wasser hergestellten, filtersterilisierten und bei 4 °C gelagerten Stoffen	Anweisungen	Endgültige mM in 1L SCFM
	Na2HPO4	0,125 Mio	Füge 10 ml jeder Brühe zu den Salzen und dem Wasser hinzu, die in Schritt 1 zubereitet	1,25
	NaH2PO4	0,13 Mio		13.30
	NH4Cl	0,228 Mio		2,28
	KNO3	0,0348 Mio.		0,35
	K2SO4	0,0271 Mio		0,27
	MOPS	1 Mio.		10.00
Schritt 3	chemisch		Anweisungen	Endgültige mM in 1L SCFM
	19 Aminosäuren Lösungen, hergestellt gemäß Abschnitt b)		10 ml jeder Brühe werden zu der in den Schritten 1 und 2 hergestellten Lösung gegeben.	Siehe Abschnitt b)
Schritt 4	Chemisch		Anweisungen	Endgültige mM in 1L SCFM
	HCl oder NaOH nach Bedarf		Zur Einstellung des pH-Werts der in den Schritten 1-3 bis 6.8 hergestellten Lösung verwenden. Rekordmenge an zugegebener Säure/Base.	N/A
Schritt 5	Chemisch		Anweisungen	Endgültige mM in 1L SCFM
	dH2O		Zu der in den Schritten 1-4 hergestellten Lösung bis zu einem Endvolumen von 960 ml geben	N/A
Schritt 6	chemisch	Feuchtigkeit von in Wasser hergestellten, filtersterilisierten und bei 4 °C gelagerten Stoffen	Anweisungen	Endgültige mM in 1L SCFM
	CaCl2	0,175 Mio	Füge 10 ml jeder Brühe zu der in den Schritten 1-5 vorbereiteten Lösung hinzu	1,75
	MgCl2	0,0606 Mio		0,61
Schritt 7	chemisch	Feuchtigkeit von in Wasser hergestellten, filtersterilisierten und bei 4 °C gelagerten Stoffen	Anweisungen	Endgültige mM in 1L SCFM
	L-Milchsäure	0,93 Mio	Machen Sie Vorräte in Wasser, pH bis 7 mit 5M NaOH. Geben Sie 10 ml in die in den Schritten 1-6 hergestellte Lösung.	9.30
Schritt 8	chemisch	Feuchtigkeit von in Wasser hergestelltem Arbeitsmaterial, unmittelbar vor der Zugabe zum Rezept	Anweisungen	Endgültige mM in 1L SCFM
	Fe(III)SO4.7H2O	0,00036 Mio.	Es wird ein 0,036 M Vormaterial hergestellt, das filtersterilisiert und bei 4 °C gelagert werden kann, solange die Lösung frei von Niederschlag bleibt. Zur Herstellung des Arbeitsmaterials werden 110 μl des Hauptmaterials zu 9,890 ml dH2O hinzugefügt und das Arbeitsmaterial zu der in den Schritten 1-7 hergestellten Lösung gegeben.	0,0036

kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg wird kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg kg

b) Zubereitung von Aminosäurebrühen; vor Gebrauch filtern, sterilisieren und bei 4°C lagern.
Aminosäure	mM Aktie	Anweisungen	Endgültiges mM in 1 L SCFM
Alanin	178	In Wasser auflösen	1.780
Arginin	30,6	In Wasser auflösen	0,306
Aspartat	82,7	Lösen in 0,5 M NaOH	0,827
Cystein	16	In Wasser auflösen	0,160
Glutaminsäure	154,9	Auflösen in 1 M HCl	1.549
Glycin	120,3	In Wasser auflösen	1.203
Histidin	51,9	In Wasser auflösen	0,519
Isoleucin	112,1	In Wasser auflösen, indem es 30 Minuten lang auf einem Schüttler auf 50 °C erhitzt	1.121
Leucin	160,9	In Wasser auflösen	1.609
Lysin	212,8	In Wasser auflösen	2.128
Methionin	63,3	In Wasser auflösen	0,633
Ornithin-HCl	67,6	In Wasser auflösen	0,676
Phenylalanin	53	In Wasser auflösen	0,530
Prolin	Nr. 166	In Wasser auflösen	1.660
Serin	144,6	In Wasser auflösen	1.446
Threonin	107,2	In Wasser auflösen	1,072
Tryptophan	1.3	Auflösen in 0,2 M NaOH	0,013
Tyrosin	80,2	Auflösen in 1M NaOH	0,802
Valin	111,7	In Wasser auflösen	1.117

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Insulinspritzen - 0,5 ml mit aufgesetzter 29G-Nadel.	VWR	BDAM324892
24-Well-Kulturplatten
70% Ethanol oder ähnliches für die Oberflächensterilisation und das Beflammen von Dissektionsgeräten
Agarplatten zur Herstellung von Schlieren von P. aeruginosa/S. aureus (beliebiges geeignetes Medium)
Agarose
Aluminiumfolie - durch Autoklavieren vorsterilisiert - zum Abdecken des Schneidebretts, auf dem Sie die Lungen sezieren werden.
Breathe-easy oder Breathe-easier Dichtungsmembran für Multiwell-Platten	Diversifizierte Biotechnologie	BEM-1 oder BERM-2000
Bunsenbrenner
Schneidebrett - wir empfehlen ein Kunststoffbrett, um eine einfache Dekontamination mit Alkohol zu ermöglichen.
Kühlbox für den Transport der Lunge ins Labor
Präparierschere in verschiedenen Größen
Dulbeccos modifiziertes Eagle medium (DMEM)
Großes Palettenmesser
Montierte Rasierklingen
Petrischalen
Schneidebrett aus Kunststoff und Aluminiumfolie zur Schaffung einer sterilen und reinigbaren Sezieroberfläche
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mittel
Scfm			Inhaltsstoffe wie in Tabelle 1 aufgeführt
Auswahl der Pinzetten (stumpfe Spitzen empfohlen)
Geeignete Behälter für die Entsorgung von kontaminierten scharfen Gegenständen und Schweinelungengewebe gemäß den Ihrer Institution Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien.