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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Dissektion von Gewebe
- Bereiten Sie das Schweinegewebe mit einem unsterilen Dissektionsarbeitsbereich vor.
- Besorge dir entkernte Schweineaugen von einem örtlichen Schlachthof, Tierversuchen oder Händlern. Behalten Sie die Augen während der Lieferung auf Eis, das in PBS getaucht ist, und verwenden Sie es sofort nach dem Erhalt.
- Schneiden Sie das extraorbitale Gewebe ab und kürzen Sie die Bindehaut, so dass nur die Hornhautschale und der Sehnerv übrig bleiben. Führen Sie die Dissektion unter unsterilen Bedingungen mit einer großen chirurgischen Schere und Pinzette in einem Grobdissektionswerkzeug durch.
- Setzen Sie die Augen wieder in frisches PBS auf Eis, bis alle Augen, die für den Versuchsaufbau benötigt werden, vorläufig/grob präpariert sind.
- Tauchen Sie die Augen 2 Minuten lang in 10%ige Betadinlösung in geschlossene Behälter und überführen Sie sie aseptisch in einen BSC II-Schrank zur Mikrodissektion (Schrank #1). Führen Sie alle nachfolgenden Arbeiten unter sterilen Bedingungen durch, um Kontaminationen während der Einrichtung zu minimieren.
- Präparieren Sie die vorderen Segmente steril.
- Nach 2 Minuten in Betadinlösung die Augen in drei aufeinanderfolgende Waschgänge mit sterilem 1x Antibiotikum-Antimykotikum-PBS (AA-PBS) geben, um überschüssige Betadinlösung von der Augenoberfläche zu entfernen und gleichzeitig die Sterilität des Augengewebes zu erhalten. Halten Sie das Tuch nach drei Wäschen bis zur weiteren Verwendung in AA-PBS.
- Hemisezieren Sie das Auge mit einer Rasierklinge/einem Skalpell und einer gebogenen Schere. Legen Sie das Auge auf eine AA-PBS-getränkte Gaze und machen Sie einen Schnitt mit einer sterilen Rasierklinge oder einem Skalpell in der Nähe des Äquators des Auges (60/40 geteilt mit 40 auf der vorderen Seite). Mit einer gebogenen chirurgischen Schere wird das Auge halbämiziert, um das vordere Auge (Hornhauthälfte) zu isolieren.
Anmerkung: Der Schnitt um das vordere Segment muss durchgehend sein, um gezackte, raue Kanten in der Sklera zu vermeiden, die nach dem Aufbau in der Organkultur zu Flüssigkeitslecks führen.
- Verwenden Sie eine Mikroschere als Schaufel, um Glaskörper aus dem vorderen Augenabschnitt zu schöpfen. Entfernen Sie die Linse mit einer Mikroschere aus dem vorderen Augenabschnitt. Die vorderen Segmente belassen Sie bis zu weiteren Dissektionsschritten in AA-PBS.
Anmerkung: Alle Augen, die präpariert werden sollen, können in diesem Schritt gehalten und nacheinander durch den Rest des Präparierprozesses geführt werden.
- Schneiden Sie mit einem Präpariermikroskop die Iris bis zur Iriswurzel allmählich radial zurück, bis das Trabekelwerk (TM) sichtbar ist. Die TM ist ein pigmentiertes Gewebe, das aus Fasern besteht, die um die Hornhauthülle herum umlaufend ausgerichtet sind. Vorsichtige Schnitte in die Iris in Richtung der Iriswurzel legen die Tiefe der TM unter dem Gewebe frei.
- Schneiden Sie 360° um die Iris in der gleichen Tiefe wie der erste Schnitt in das Gewebe, um die gesamte TM-Region freizulegen. Reinigen Sie bei Bedarf alle verbleibenden Irisreste, die TM abdecken.
- Schneiden Sie die Ziliarkörperreste hinter der TM ab, so dass nur ein dünnes Gewebeband hinter der TM-Region (ca. 1 mm) übrig bleibt.
- Legen Sie das präparierte vordere Segment (AS) in ein Medium, bis es weiter in der Organkultur des vorderen Segments (ASOC) in einem BSC II-Schrank (Schrank #2) eingerichtet wird.
Anmerkung: Vor der Einrichtung des ASOC können alle Augen auf diesen Punkt gerichtet werden, wenn ein einzelner Benutzer die Dissektion und den Zusammenbau von Organkulturschalen durchführt.