Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Einrichten der vorderen Segmente in Organkulturschalen
- Legen Sie ein einzelnes vorderes Segment (AS) in eine Petrischale mit umgekehrtem AS (Becher nach oben). Verwenden Sie ein Wattestäbchen, befeuchten Sie das Medium und tupfen Sie es vorsichtig in die Mitte der Hornhaut, um alle Pigmente zu entfernen. Wische mit einer Pinzette, um das Auge zu halten, und demselben Tupfer das Wattestäbchen um die Sklera herum, um überschüssiges Pigment zu entfernen.
- Drehen Sie das AS um und legen Sie es auf den unteren Teil der Schale über den erhöhten Bereich, wobei Sie die Hornhaut über dem erhöhten Bereich in der Schale zentrieren. Setzen Sie den Spannring auf das neu platzierte AS.
- Setzen Sie vier Schrauben in die entsprechenden Löcher ein, um den Ring mit dem AS unter dem Ring an Ort und Stelle zu halten. Ziehen Sie die Schrauben vorsichtig mit dem Winkelschlüssel von Hand fest.
Anmerkung: Der Anzugsschritt wird während des gesamten Experiments täglich durchgeführt, daher besteht das Ziel des ersten Anziehens darin, sicherzustellen, dass das Medium nicht ausläuft und gleichzeitig ein Brechen des Klemmrings vermieden wird.
- Legen Sie bei einem sterilen Petrischalen-Set die Oberseite über die Schale und drehen Sie den Aufbau um. Befestigen Sie den Geschirrständer. Befestigen Sie die fluidischen Anschlüsse mit O-Ringen an den Gewindeanschlüssen an der Unterseite der Schale.
- Schließen Sie an einen fluidischen Anschluss eine 18 G 90° gebogene Nadelnabe, ein Schlauchstück, eine 18 G Nadelnabe, einen Nylon-Spritzenvorsatzfilter, ein Dreiwegeventil und eine mit Medien gefüllte 20-ml-Spritze an.
- Befestigen Sie am zweiten Fluidikanschluss eine um 90° gebogene Nadelnabe um 18 G, die Schlauchlänge, eine 18-G-Nadelnabe, ein Dreiwegeventil und den Zylinderteil einer sterilen 10-ml-Spritze (dies dient als Reservoir zum Auffangen von Flüssigkeit und Blasen aus dem ASOC).
- Wenn die Dreiwegeventile entsprechend den Spritzen geöffnet sind, drücken Sie das Medium vorsichtig durch das System, indem Sie den in Schritt 1.5 beschriebenen Fluidikanschluss verwenden, um das AS aufzublasen, das Medium in den Schlauch und schließlich in das Reservoir zu füllen.
Anmerkung: Wenn Medien in die ASOC-Schale eindringen, ist der AS mit dem Klemmring nicht fest genug gesichert.
- Entfernen Sie Blasen, indem Sie das Medium vorsichtig in die Schale drücken und die Schale umdrehen, um die Blasen in den Behälter herauszudrücken.
- Stellen Sie die Schüssel auf und stellen Sie sich aufrecht hin. Legen Sie den unteren Teil einer Petrischale unter die Füße des Ständers und achten Sie darauf, dass sich der Schlauch nicht verfängt.
2. Beginn der Organkultur im vorderen Segment
- Das ASOC ist nun bereit für die Inkubation. Stellen Sie die ASOC-Schale in den Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5 % CO2). Stellen Sie sicher, dass die Höhe der ASOC-Schale im Inkubator über den Druckmessköpfen bekannt ist und berücksichtigt wird, um den Augeninnendruck (IOD) genau zu berechnen.
- Führen Sie die Schlauchleitungen durch den Boden der 37 °C und 5 % CO2 -Inkubatortür, so dass sie das Öffnen und Schließen der Tür nicht beeinträchtigen. Setzen Sie die 20-ml-Spritze bei 2,5 μl/min auf das Spritzenpumpenset.
- Positionieren Sie die Schlauchleitung mit dem Behälter am Druckmessumformer. Verbinden Sie das seitliche 3-Wege-Ventil mit dem Druckmessumformer, während PBS durch die Leitung fließt, um zu verhindern, dass Luftblasen in die Schlauchleitungen gelangen.
Anmerkung: Entleeren Sie das PBS aus den Reservoirs, nachdem das System eingerichtet wurde, um die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination des Reservoirs mit mikrobiellem Wachstum für die Dauer der Organkultur zu verringern.
- Initiieren Sie die IOP-Datenerfassung, indem Sie zunächst sicherstellen, dass eine microSD-Karte zum Speichern von Datendateien vorhanden ist. Schalten Sie dann die Einrichtung des Druckmessumformers ein, um mit der Datenerfassung zu beginnen.
3. Tägliche Wartung des ASOC
- Nachdem das ASOC 24 Stunden Zeit hatte, sich auszugleichen, nehmen Sie die Schalen aus dem 37 °C und 5 % CO2 -Inkubator und stellen Sie sie in den Schrank für biologische Sicherheit (BSC) II.
Anmerkung: Bei der Druckdatenerfassung sehen diese Zeiträume wie Spitzen aus, wenn die ASOCs aus dem Inkubator entnommen (Höhenänderung) und im Schrank angepasst werden.
- Überprüfen Sie, ob jede Schale auf der Petriplatte undicht ist. Falls vorhanden, prüfen Sie, ob die Fluidik unter der Schale fest sitzt, und ziehen Sie sie gegebenenfalls wieder fest. Prüfen Sie, ob der Geschirrdeckel undicht ist, indem Sie die Schrauben im Klemmring mit einem sterilen Winkelschlüssel festziehen.
Anmerkung: Das AS-Skleragewebe wird zusammengedrückt und die Dicke um 24 Stunden reduziert, und der Klemmring muss festgezogen werden.
- Saugen Sie das Medium gut aus der Schale an.
Anmerkung: Das Trabekelwerk filtert die Flüssigkeit aus dem Medium, das in das ASOC gepumpt wird. Daher werden die Medien in der ASOC-Schüssel entlang der Ränder vorhanden sein.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.7 und 1.8, um eingeschlossene Luftblasen zu entfernen.
- Füllen Sie die Spritzen an den Spritzenpumpen nach, stellen Sie sicher, dass die Spritzenpumpen in Betrieb sind, und bestätigen Sie die Ausrichtung der Ventile für die Perfusion in das ASOC. Stellen Sie die ASOC-Schüssel wieder in den Inkubator mit 37 °C und 5 % CO2 ein.
Anmerkung: Optimalerweise sollten diese Schritte täglich durchgeführt werden. Die Verwendung eines Startvolumens von 20 mL des Mediums, des ASOC-Dish-Well-Volumens und einer Pumprate von 2,5 μL/min sollte jedoch ausreichen, um das System mehrere Tage lang ungestört laufen zu lassen.
