Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Schneiden von Schweineherzgewebe
- Richten Sie das Gewebebad auf dem Vibratom ein, fügen Sie Eis zum Kühlmantel des Gewebebades hinzu und geben Sie dann die Lösung von Tyrode in das Gewebebad. Stellen Sie ein 1-Liter-Plastikglas auf, um die Entsorgung von geschmolzenem Eis aus dem Kühlmantel des Gewebebads aufzufangen. Mischen Sie für 1 l der Tyrode-Lösung in Scheiben 3 g/l 2,3-Butandion-Monoxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-Glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 mL 1 M Lösung), 1,8 mM CaCl2 (1,8 mL 1 M Lösung), bis zu 1 L ddH2O. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,40 ein. Anschließend wird die Lösung mit einem 1.000 mL, 0,22 μm Vakuumfilter/Lagersystem filtriert und über Nacht bei 4 °C gelagert.
- Übertragen Sie das Schweineherz unter der Biosicherheitswerkbank in ein Tablett mit 1 l frischer kalter kardioplegischer Lösung. Mischen Sie für 1 l der kardioplegischen Lösung 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl2 (1,2 mL von 1 M Lösung), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl2 (3,25 g), 10 mM NaHCO3 (0,84 g), 1 U/mL Heparin, bis zu 1 l ddH2O. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,40 ein. Anschließend wird die Lösung mit einem 1.000 mL, 0,22 μm Vakuumfilter/-speichersystem filtriert und über Nacht bei 4 °C gelagert.
Anmerkung: Fügen Sie am Tag des Schneidens 1.000 U/L Heparin in Kardioplegielösung hinzu.
- Präparieren Sie das Herz, um den linken Ventrikel mit einziehbaren, sterilen Skalpellen zu isolieren. Schneiden Sie dann den linken Ventrikel mit einer Rasierklingen-Rechteckklinge in Blöcke von je 1-2 cm3. Verwenden Sie ein Stück zum Schneiden und bewahren Sie die restlichen Stücke in einem 50-ml-Röhrchen in kalter Tyrode-Lösung auf Eis auf, um sie später bei Bedarf zu schneiden.
Anmerkung: Massieren Sie das Taschentuch vor dem Schneiden mit den Händen, insbesondere wenn dies der zweite Block ist. Das Massieren hilft, die richtige Muskelfaserkonfiguration wiederherzustellen und beugt Steifheit innerhalb des Herzblocks vor.
- Geben Sie 1−2 Tropfen Gewebekleber (Materialtabelle) auf den Probenhalter aus Metall und kleben Sie ein Stück des 4%igen Agarblocks mit einer Oberfläche von ca. 1 cm2 auf.
- Geben Sie 1-2 Tropfen Gewebekleber auf den Agar.
- Kleben Sie den Herzblock mit der Herz-Epikard-Seite nach unten auf den Agar und achten Sie darauf, dass er so flach wie möglich ist. Übertragen Sie dann den Gewebehalter mit dem Herzblock in seine Position im Schnittbad des Vibratoms.
- Befestigen Sie den Sauerstoffschlauch an das Schneidebad und die mit der Tyrode-Lösung gefüllte Metallwanne zum Auffangen der Scheiben (sauerstoffreiches Tyrode-Bad). Geben Sie dann 40 μm Zellsiebe in die Metallschale, um die Scheiben nach dem Schneiden zu sammeln.
- Einstellen der Schneidposition
- Passen Sie mit der Vibratome-Bediensoftware und dem Armaturenbrett die Höhe der Klinge/Probe an. Wählen Sie die Schaltfläche Höhe aus und befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Höhe anzupassen. Im Idealfall halten Sie die Klinge nahe an der Oberseite des Gewebes, aber unterhalb der Papillenmuskulatur und stellen Sie sicher, dass das Gewebe und die Klinge mit Flüssigkeit bedeckt sind, bevor Sie schneiden.
- Stellen Sie ein, wo mit dem Schneiden des Taschentuchs begonnen werden soll, indem Sie die Vorschubtaste auswählen. Drücken Sie die Schneidetaste und erhöhen Sie die Geschwindigkeit, indem Sie die Klinge mit dem Knopf zum Rand des Gewebes bewegen. Drücken Sie dann erneut Slice, um den Vorgang zu stoppen, und drücken Sie die Vor-Taste, um den Vorgang zu deaktivieren.
- Passen Sie die Schnittparameter an: Vorschubgeschwindigkeit = 0,03 mm/s, Vibrationsfrequenz = 80 Hz und horizontale Vibrationsamplitude = 2 mm. Starten Sie dann das Schneiden, indem Sie die Slice-Schaltfläche auswählen.
- Lassen Sie das Vibratom schneiden, bis es das Ende des Gewebes erreicht, aber bevor es auf das hintere Ende des Probenhalters trifft. Drücken Sie an dieser Stelle erneut auf Slice, um den Vorgang zu stoppen. Drücken Sie die Return-Taste, um zur Ausgangsposition zurückzukehren.
- Wählen Sie die automatische Wiederholung (klicken Sie zweimal darauf), damit das vibrierende Mikrotom den Slicing-Vorgang bis zu 99 Mal automatisch wiederholen kann.
- Sammeln von Slices
- Warten Sie, bis die Scheiben in voller Länge sind und gut aussehen (nachdem Sie die Papillenmuskelschichten überwunden haben), und beginnen Sie dann, die Scheiben zu sammeln.
- Sammeln Sie die Scheiben mit einer Pasteur-Plastikpipette, die mit kalter Tyrode-Lösung gefüllt ist, um das Gewebe vorsichtig aus dem Bad zu greifen. Gegebenenfalls mit Pinzette und Federschere die Scheibe vom Herzblock trennen, wenn das Gewebe noch anhaftet.
- Übertragen Sie die Scheibe auf ein Zellsieb im sauerstoffhaltigen Tyrode-Bad (siehe Schritt 1.7) und verwenden Sie die Flüssigkeit in der Pasteur-Plastikpipette, um das Gewebe flach auf einem der Zellsiebe aufliegen zu lassen, und fügen Sie dann eine Metallscheibe auf der Oberseite hinzu, um das Gewebe nach unten zu halten.