Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Isolierung von Schweine-Kumulus-Oozyten-Komplexen
- Zur Entnahme von Material für die Isolierung von Eierstockfollikeln werden Eierstöcke von Schweinen aus präpubertären Jungsauen (ca. 6-7 Monate alt, mit einem Gewicht von 70 bis 80 kg) in einem örtlichen Schlachthof exzidiert. Wählen Sie in jedem Versuch etwa 20 von 10 Schweine-Eierstöcken für die Isolierung von Cumulus-Eizell-Komplexen (KOK) aus.
Anmerkung: Unter der Annahme, dass jeder Eierstock 3–5 Follikel liefert, variiert die Gesamtzahl der Follikel zwischen 60 und 100.
- Legen Sie die Eierstöcke in eine Thermoskanne mit steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4; 38 °C), die 1% ige antimykotische Lösung (AAS) enthält. Stellen Sie sicher, dass das Versuchsmaterial innerhalb von 1 h ins Labor transportiert wird, wo es zweimal mit sterilem PBS-haltigem Antibiotika gespült wird.
- Nach dem Spülen der Eierstöcke werden sie in das mit Handhabungsmedium (HM) gefüllte Becherglas (Table of Materials) umgefüllt und in einem Inkubator bei 38 °C für die Dauer aller Manipulationen gelagert.
Anmerkung: Für optimale Ergebnisse beim Umgang mit der Eizelle führen Sie alle Eingriffe in DMEM/F12-Medium (Handhabungsmedium, HM) unter Zusatz von 2,5 % Antibiotikum/AAS und 10 % fötalem Rinderserum (FBS) durch und kontrollieren Sie den pH-Wert auf dem CO2 -Gehalt in der Umgebung, auf einem Heiztisch mit Temperaturregelung (38 °C) und unter der Laminar-Flow-Haube, um die bakterielle Kontamination zu minimieren.
- Aus großen Schweinefollikeln (6-8 mm Durchmesser) wird Follikelflüssigkeit (FF) durch Aspiration und Zentrifugation bei 100 x g für 10 min bei Raumtemperatur gesammelt. Danach wird der Überstand mit einer sterilen Spritze, die an 0,2 μm Membranporenfiltern befestigt ist, filtriert und bei -80 ><°C eingefroren.
Anmerkung: Verwenden Sie eine Insulinspritze (u-40) zur Aspiration von Follikelflüssigkeit.
- Stellen Sie sicher, dass nur gesunde, mittelgroße Follikel (4-6 mm Durchmesser) für die KOK-Isolierung ausgewählt werden.
Anmerkung: KOK Grad I, die eine intakte und runde Eizelle mit homogenem Ooplasma und einem mehrschichtigen (mindestens 3-4) kompakten Kumulus besitzen, gelten als geeignet für ein weiteres 3D-IVM-Verfahren.
- Um KOK zu isolieren, geben Sie 2-3 Eierstöcke in eine sterile Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm, die mit HM gefüllt ist. Isolieren Sie KOK aus mittelgroßen Follikeln, indem Sie eines der folgenden Verfahren befolgen.
- Schneiden Sie die Oberfläche der hervorstehenden Eierstockfollikel vorsichtig mit einer sterilen chirurgischen Klinge 15C ab. Dies führt dazu, dass die Follikelflüssigkeit zusammen mit den KOK in die Petrischale fließt.
- Aspirieren Sie den follikulären Inhalt mit einer 28-G-Nadel der Größe 5/8", die an einer Einwegspritze befestigt ist, und übertragen Sie sie in die Petrischale.
Anmerkung: Entsorgen Sie die Reste des Eierstockgewebes. Die nachfolgenden Isolationsstufen werden unter einem Stereomikroskop durchgeführt.
- Bereiten Sie 3–5 60 mm IVF-Petrischalen vor.
- Geben Sie 1 ml HM in die zentralen Vertiefungen und geben Sie 3-4 Tropfen HM (50 μl pro Tropfen) in die äußeren Ringe.
- Bewegen Sie dann mit einer Mikropipette aus Polycarbonat die unbeschädigten KOKs in Tropfen HM in die äußeren Ringe, um sie 3-4 Mal kurz zu spülen.
- Übertragen Sie diese zum Schluss einzeln in die zentrale Vertiefung. Bewahren Sie diese IVF-Platten für weitere Eingriffe in einem Inkubator auf.