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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Verkapselung in superhydrophoben Mikrobioreaktoren aus fluoriertem Ethylenpropylen (FEP).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle In-vitro-Reifungsverfahren (IVM) auf einem thermostatisch kontrollierten Tisch durchgeführt werden und die Cumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) während der gesamten Handhabung bei 38 °C gehalten werden.
- Bereiten Sie eine 30-mm-Petrischale mit 5 g FEP-Pulverbett mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 1 μm
vor
HINWEIS: Es ist wichtig, frisches FEP-Pulver zu verwenden. Das wiederverwendete FEP neigt dazu, sich zu verklumpen und zu verklumpen.
- Verteilen Sie ein einzelnes Tröpfchen Reifungsmedium (MM) (~30 μl Volumen) mit 3-5 KOK auf dem Bett des FEP-Pulvers. Drehen Sie die Platte vorsichtig in kreisenden Bewegungen, um sicherzustellen, dass diese Partikel die Oberfläche des Flüssigkeitstropfens und der gebildeten flüssigen Murmeln (LM) vollständig bedeckt haben.
- Aufgenommenes geformtes LM mit einer Pipette mit einer 1.000 μL Spitze.
HINWEIS: Schneiden Sie die Pipettenspitze am Rand ab, um sie an den Durchmesser des LM (4-5 mm) anzupassen. Der ungefähre Durchmesser einer solchen präparierten Spitze sollte etwas größer sein als der des LM.
- Bereiten Sie mehrere 60 mm Petrischalen für die In-vitro-Fertilisation (IVF) vor. Geben Sie 3-4 ml steriles Wasser in die äußeren Ringe, um die Feuchtigkeitskammer vorzubereiten. Platzieren Sie als Nächstes ein LM in die zentrale Vertiefung.
HINWEIS: Dieses Verfahren erfordert gutes handwerkliches Geschick und Präzision - wenn die Murmel unachtsam platziert wird oder auch aus geringer Höhe herunterfällt, wird sie zerstört.
- Inkubieren Sie Murmeln 4 Tage lang bei 38 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2.
- Wechseln Sie das Medium täglich nach dem Verfahren: Tragen Sie 30 μl MM auf jedes LM auf, was zu einer Ausbreitung führt, da der direkte Kontakt mit der Flüssigkeit die Hydrophobie der beschichteten FEP-Pulver stört. Wenn sich der Marmorgehalt aufgelöst hat, werden die aus dem Bioreaktor freigesetzten KOK in einen Tropfen frisches MM in die Petrischale überführt.
HINWEIS: Um freigesetzte KOK präzise zu übertragen, verwenden Sie eine Mikropipette aus Polycarbonat.
- Nach mehreren Wäschen in MM (3-4 Mal), um FEP-Partikel zu entfernen, übertragen Sie diese mit 30 μL frischem MM auf das FEP-Pulverbett. Drehen Sie die Platte vorsichtig in kreisenden Bewegungen, um sicherzustellen, dass die Pulverpartikel die Oberfläche des Flüssigkeitstropfens vollständig bedecken und ein neues LM bilden.
- Nehmen Sie geformtes LM mit einer Pipette mit einer 1.000-μl-Spitze auf.
- Geben Sie 3-4 ml steriles Wasser in die äußeren Ringe, um die Feuchtigkeitskammer vorzubereiten. Platzieren Sie anschließend ein LM in die zentrale Vertiefung der IVF-Petrischale.
HINWEIS: Die transparente Beschichtung aus FEP-Pulver ermöglicht die Überwachung des LM-Gehalts mit einem Lichtmikroskop.