Lasergestützte selektive Ablation von Hornhaut-Endothelzellen von Schweinen: Eine Technik zur Induktion einer fokussierten Schädigung der Hornhaut von Schweinen für ex vivo-Studien

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Holzhey, A. et al., Entwicklung eines nichtinvasiven, lasergestützten experimentellen Modells des Verlusts von Hornhaut-Endothelzellen. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt ein nicht-invasives lasergestütztes Verfahren zur selektiven Schädigung der Hornhaut-Endothelzellen im Schweineauge. Das entwickelte ex vivo-Modell der Schädigung von Endothelzellen kann zur Untersuchung von Erkrankungen des Hornhautendothels verwendet werden.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Vorbereitung der Organkultur und Laserbehandlung

Holen Sie sich frisch entkernte Schweineaugen aus dem örtlichen Schlachthof. Halten Sie sie kühl (4 °C) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit L-Glutamin, Natriumpyruvat, Penicillin/Streptomycin (1%) und Schweineserum (10%), im Folgenden in diesem Artikel als Vollmedium bezeichnet.
Entfernen Sie extrazelluläres Gewebe mit einer Schere und weichen Sie die Augen 5 Minuten lang in 5%iger Povidon-Jod-Augenlösung ein, bevor Sie sie bis zur Verwendung in sterilisierte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) legen.
Untersuchen Sie die Augen auf wichtige Pathologien des vorderen Segments, wie z. B. Hornhautnarben, Ödeme und andere Trübungen mit einem optischen Kohärenztomographen im Spektralbereich (Materialtabelle).
Positionieren Sie die Augen vor einer Spaltlampeneinheit, die mit einem Nd:YAG-Laser (Table of Materials) bestückt ist, der eine Wellenlänge von 1.064 nm und einen Brennfleckdurchmesser von 10 μm in Luft hat.
Anmerkung: Für eine optimale Positionierung wird eine 3D-gedruckte Haltevorrichtung verwendet, die so konzipiert wurde, dass sie das Auge fest hält, ohne zu viel Druck auf es auszuüben (Abbildung 1).
Verwenden Sie eine 12-fache Vergrößerung und lenken Sie die Beleuchtung ab, um die einzelnen Hornhautschichten sichtbar zu machen.
Stellen Sie die Pulsenergie (z. B. 1,6 mJ) und den Fokuspunkt (z. B. 0,16 mm) für die selektive Ablation von Endothelzellen ein.
Platzieren Sie eine durchsichtige Hornhautparazentese in der Nähe des Limbus und injizieren Sie ein Viskoelastikum (Materialtabelle), um die Vorderkammer zu stabilisieren.
Exzitieren Sie die laserbehandelte zentrale Hornhaut mit einem 8 mm Trepan.
Legen Sie die herausgeschnittene Hornhaut mit der Endothelstelle nach oben in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte und inkubieren Sie die Probe in 3 mL Vollmedium bei 37 °C für bis zu 3 Tage.
Anmerkung: In diesem Schritt können dem Medium potenzielle zytoprotektive Wirkstoffe zugesetzt werden.

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Versuchsaufbau.(A) Die Augen wurden in einer teilweise 3D-gedruckten Haltevorrichtung fixiert, die eine präzise Ausrichtung in Bezug auf den Laserstrahl ermöglichte. (B) Vor der Laserbehandlung wurde das Gewebe mit einem optischen Kohärenztomographen des vorderen Augenabschnitts untersucht, um nach schwerwiegenden Pathologien des vorderen Augenabschni...