Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Tiere und Unterbringung
- Erwerben Sie neuseeländische weiße (NZW) Kaninchen mit einem Gewicht von 2-3 kg.
- Halten Sie die Kaninchen einzeln in Käfigen mit strenger Temperatur- (65 ± 5 °F) und Luftfeuchtigkeit (45 ± 5 %). Die Beleuchtung sollte einen Ein-/Ausschaltzyklus von 12 Stunden haben.
- Bieten Sie unbegrenzten Zugang zu Wasser und Standard-Kaninchenfutter. Eliminieren Sie diätetische Anreicherungen, da sie Vitamin A enthalten können, das das Auge beeinflusst.
- Akklimatisieren Sie die Tiere mindestens 2 Wochen lang, bevor Sie zu Beginn der Maßnahmen oder die Einleitung eines trockenen Auges beginnen.
2. Methoden der Anästhesie und Euthanasie
HINWEIS: Alle Verfahren erfordern eine leichte Sedierung, mit Ausnahme der Con A-Injektion, die eine moderate Sedierung erfordert.
- Für eine leichte Sedierung injizieren Sie Acepromazin (1 mg/kg) subkutan über die Schultern mit einer 26-Gauge-Nadel. Endpunkt für eine milde Sedierung: Die Tiere behalten eine entspannte Kopfhaltung bei, wobei die Ohrläppchen nicht mehr vollständig aufrecht stehen.
Anmerkung: Wenn der entsprechende Endpunkt nicht erreicht wird, kann eine zusätzliche Injektion von Acepromazin verabreicht werden. Tiere sollten immer wach bleiben, auf Berührungen mit ihren Schnurrhaaren reagieren und niemals eine verlangsamte Atmung zeigen.
- Bei mäßiger Sedierung geben Sie den Tieren zuerst Acepromazin wie oben. Nachdem der Endpunkt erreicht ist (siehe Hinweis oben), geben Sie Isofluran unter Verwendung einer Gasmaske mit einemO2-Durchfluss von 1 l/min und einer Isofluranabgabe von 5 % (Abbildung 1).
- Verabreichen Sie Isofluran, bis der Körpertonus des Kaninchens vollständig entspannt ist und die Ohren völlig schlaff sind.
Anmerkung: Es sollten keine ausgleichenden Muskelbewegungen auftreten, wenn das Tier auf die Seite gedreht wird. Die Atmung bleibt immer spontan.
- Die spontane Genesung tritt innerhalb von 2-5 Minuten ein: Zu den Anzeichen gehören spontane Kopfbewegungen und ein erhöhter oder normaler Muskeltonus. Nachdem das experimentelle Verfahren mit mäßiger Sedierung abgeschlossen ist, beobachten Sie die Kaninchen etwa 30 Minuten lang oder bis sich ihr Verhalten wieder normalisiert.
Anmerkung: Eine Augensalbe ist bei keiner der beiden Formen der Sedierung erforderlich. 1) Bei leichter Sedierung sind die Tiere immer noch wachsam und behalten einen Blinzelreflex bei. Bei moderater Sedierung ist die Hemmung des Blinzelreflexes so kurz, dass die Augenoberfläche nicht gefährdet ist. 2) Das Auftragen der Augensalbe auf die Augenoberfläche schließt die Visualisierung der während des Tests bewerteten Strukturen aus.
- Euthanasie: Verwenden Sie eine Überdosis intravenös verabreichtes Pentobarbital (100 mg/kg).
3. Einleitung und Behandlung des trockenen Auges
HINWEIS: Drei Teile des orbitalen Tränendrüsensystems werden injiziert.
- Die Kaninchen werden mit Acepromazin 0,2 mg/kg subkutan sediert.
- Scheren Sie das Fell im periorbitalen und Kopfhautbereich ab und entfernen Sie alle Fellreste vollständig mit Nair. Lassen Sie die Haut vollständig glatt, um die anatomischen Merkmale und die US-geführte Injektion von Concanavalin A besser sichtbar zu machen (Abbildung 2).
- Induzieren Sie eine mäßige Sedierung, wie oben beschrieben.
- Injektion des palpebralen Anteils der oberen Tränendrüse (PSLG)
Anmerkung: Führen Sie zuerst die Injektion von PSLG durch.
- Tragen Sie 25 μl konservierungsmittelfreies Lidocain 1% mit einer Mikropipette auf das entsprechende Auge auf.
- Drehen Sie das obere Augenlid um und üben Sie leichten medialen Druck auf den hinteren Orbitalrand aus, bis die Protuberanz, die den palpebralen Teil der Drüse markiert, zu sehen ist. Das PSLG erscheint als kleine knollige Erhebung im hinteren (temporalen) Teil des Oberlids.
Anmerkung: Um das Drüsengewebe während des Lernprozesses zu betrachten, tragen Sie 5% Fluorescein auf den Bereich auf (Abbildung 3A). Tränen strömen aus dem knolligen PSLG. Die Anwendung von Fluorescein ist für die Verabreichung von Con A nicht erforderlich; Es wird nur zu Illustrationszwecken gemacht, um das Drüsengewebe zu zeigen.
- Mit einer feinzahnigen Pinzette und einer 27-Gauge-Nadel auf einer Tuberkulinspritze dringen Sie mit einem transkonjunktivalen Zugang direkt in die Drüse ein. Schieben Sie die Nadel 2 mm in das Gewebe vor und injizieren Sie 500 μg Con A in einem Volumen von 0,1 mL (Abbildung 3B).
HINWEIS: Diese Injektion kann manchmal schmerzhaft sein. Falls erforderlich, halten Sie die Tiere bis zum Abschluss dieser Injektion unter Isofluran.
