Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Isolierung von Endothelzellen der Schweineaorta
- Entfernen Sie unter aseptischen Bedingungen die Schweineaorta aus dem Waschpuffer und legen Sie sie auf eine 150-mm-Petrischale (Abbildung 1A).
- Schneiden Sie vorsichtig die beiden Enden der Aorta ab und entfernen Sie überschüssiges Gewebe um die Aorta herum erneut mit einer sterilen Pinzette und Schere (Abbildung 1B). Waschen Sie die Außen- und Innenseite der Aorta (über der Kulturschale bei Raumtemperatur) mit 20-50 ml Waschpuffer: 1x PBS-Lösung (pH 7,4) mit 1% (v/v) Penicillin/Streptomycin.
Anmerkung: Versuchen Sie, nur den Bereich zu schneiden, an dem die Klemmen während der Operation platziert wurden, da einige ECs in diesem Bereich beschädigt wurden, und entfernen Sie überschüssiges Gewebe und arterielle Seitenäste.
- Führen Sie eine chirurgische Naht durch die Aorta und binden Sie dann ein Ende der Aorta mit der chirurgischen Naht (5-0, 90 cm, Materialtabelle). Halten Sie die chirurgische Naht im Inneren der Aorta (Abbildung 1C,D).
- Fixieren Sie die Aorta vorsichtig mit einer Pinzette in der Nähe des gebundenen Endes und ziehen Sie dann langsam an der chirurgischen Naht, um die Aorta umzukehren, bis die endotheliale Oberfläche der Aorta freigelegt ist (Abbildung 1E-G).
Anmerkung: Achten Sie darauf, die Aorta in der Nähe des abgebundenen Endes zu fixieren und die Aorta nicht fest zu fixieren, da sonst die Aorta nicht durch Ziehen der chirurgischen Naht rückgängig gemacht werden kann.
- Waschen Sie die endotheliale Oberfläche der Aorta 3x (10 mL pro Waschgang) mit Waschpuffer und entsorgen Sie dann diese Lösung. Legen Sie die Aorta in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und bedecken Sie die Aorta mit 10 ml 0,005 % Kollagenase-IV-Verdauungslösung im Röhrchen (Abbildung 1H).
Anmerkung: Die 0,005%ige Kollagenase IV-Verdauungslösung vor der Verdauung bei 37 °C vorwärmen.
- 15 Minuten lang bei 37 °C inkubieren. Die verdaute Aorta und die Verdauungslösung in eine 100-mm-Kulturschale geben und die Wirkung von 0,005 % Kollagenase i.v. durch Zugabe von 10-15 ml vorgekühltem Stopppuffer stoppen: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS und 1 % P/S.
Anmerkung: Die empfohlene Verdauungszeit liegt zwischen 10 und 20 Minuten. Stellen Sie sicher, dass die Endotheloberfläche der Aorta vom Stopppuffer bedeckt ist.
- Kratzen Sie die pAECs vorsichtig mit einem Zellschaber von der Innenfläche der Aorta ab (Abbildung 1I). Waschen Sie die abgeschabte Aorta 3x mit Waschpuffer (5 mL pro Zeit). Geben Sie die Lösung aus der Kulturschale in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie den Boden der Kulturschale 2x mit Waschpuffer (5 mL pro Zeit) und geben Sie die Lösung erneut in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen.
Anmerkung: Kratzen Sie vorsichtig in eine Richtung und drücken Sie nicht zusammen. Berühren Sie das Taschentuch nicht in der Nähe der Ränder und Löcher. Es wird empfohlen, 5-8x zu kratzen.
- Das Röhrchen wird bei 600 x g für 6 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und 10 ml Lösung werden am Boden eines 50-ml-Zentrifugenröhrchens belassen. Geben Sie 20 mL Waschpuffer in das 50 mL Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie die Pellets. Vermeiden Sie Blasen während dieses Schritts.
- Bei 600 x g für 6 min bei 4 °C zentrifugieren. Den Überstand langsam verwerfen. Die Zellpellets werden mit 1 mL Nährmedium resuspendiert und gut vermischt.
Anmerkung: Die erhaltene durchschnittliche Anzahl von ECs pro cm Aorta beträgt 1,9 x 10⁵ ± 1,4 x 10⁴ (mittlere ± SD, n = 3).
- Zählen Sie die Zellen mit einem Zellzähler. Plattieren und kultivieren Sie die Zellen in einem Gefäß, ohne irgendwelche Materialien entsprechend der Zellnummer zu beschichten. Wenn die Zellzahl kleiner oder gleich 1,0 x 10⁶ ist, werden die Zellen in einem 25 cm² großen Kolben kultiviert. Ist die Zellzahl größer als 1,0 x 10⁶, werden die Zellen in mehreren 25 cm² großen Kolben (1,0 x 10⁶ Zellen pro Kolben) kultiviert. Stellen Sie den Kolben (ohne Schütteln) bei 37 °C und 5 % CO₂ in einen Inkubator und wechseln Sie das Medium alle 2−3 Tage.
Anmerkung: Einige Zellen werden durch den Zellschaber beschädigt. Ein Zellviabilitätsassay ergab, dass der Anteil lebender Zellen 95,7 % ± 1,7 % betrug (Mittelwert ± SD, n = 3). Die Verdopplungszeit der isolierten Zellen beträgt etwa 1-2 Tage.
