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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Isolierung der kurzen hinteren Ziliararterien
Schweineaugen zusammen mit dem Sehnerv und extraokulärem Gewebe wurden unmittelbar nach dem Tod entnommen. Die enukleierten Augen wurden in eiskalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ins Labor transportiert und sofort verwendet.
HINWEIS: Das Schweineauge ist grundsätzlich in den vorderen (Abbildung 1A) und den hinteren Bereich (Abbildung 1B) unterteilt.
- Legen Sie den Augengloben in eine Präparierkammer, die eiskalten Krebs-Henseleit (K-H)-Puffer enthält. Schneiden Sie die umliegenden Muskeln und das Gewebe vorsichtig mit einer scharfen Mayo-Schere ab.
Anmerkung: Zur Herstellung von Krebs-Henseleit (K-H)-Puffer werden die folgenden Chemikalien (27,68 g NaCl, 8,4 g NaHCO, 3,1,4 g KCl, 1,18 g MgSO4 und 0,64 g KH2PO4) in ein trockenes und sauberes konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen und 1,47 g CaCl2 und 8,0 g Glukose in ein anderes Röhrchen gewogen. Die Pulvermischung dieser Chemikalien sollte an einem kühlen und trockenen Ort gelagert werden. Die Mischung aus CaCl2 und Glukosepulver wird am besten frisch zubereitet, um Feuchtigkeitsaufnahme und Verklumpung zu verhindern.
- Machen Sie einen Schnitt mit einem Skalpell und schneiden Sie den Globus entlang der Äquatorebene mit einer scharfen Mayo-Schere, bis das Auge in die vordere und hintere Hälfte geteilt ist. Entfernen Sie so viel Glaskörper wie möglich aus der hinteren Hälfte des Auges mit einer Zange nach Standardmuster.
Anmerkung: Die Trennung des Augenglobens in zwei Hälften ermöglicht die Isolierung der kurzen hinteren Ziliararterien (sPCA) mit Leichtigkeit, ohne dass sich ein Auge in der Präparierschale bewegt. Dieser Schritt ist jedoch nicht obligatorisch. Die Gefäße können auch isoliert werden, ohne den Augengloben zu öffnen.
- Verwenden Sie Präpariernadeln, um die hintere Hälfte des Auges vorsichtig mit der Netzhautseite nach unten und dem Sehnerv nach oben zum Versuchsleiter hin festzunageln.
- Schneiden Sie das Bindegewebe, das den Sehnerv umgibt, vorsichtig ab, um das darunter liegende retrobulbäre Gefäßsystem mit einer Student Vannas Federschere freizulegen.
- Die sPCA kann als kurze Äste von Gefäßen (zwischen 5-8 Äste) gesehen werden, die die Sklera durchdringen und den Sehnervenkopf umschließen (Abbildung 1C). Isolieren Sie die paraoptische und distale sPCA zusammen mit dem umgebenden Bindegewebe mit einer Präzisionspinzette vom Typ 5 und einer Kapsulotomieschere von Vannas (Abbildung 1D).
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass der K-H-Puffer während des gesamten Isolierungsvorgangs eiskalt bleibt. Es wird dringend empfohlen, den Puffer je nach Umgebungstemperatur alle 20-30 Minuten zu wechseln.
2. Probenvorbereitung
- Entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe aus den Arteriensegmenten mit einer extra feinen Typ-5-Präzisionspinzette und einer Vannas-Kapsulotomieschere unter einem Stereomikroskop und spülen Sie die isolierten Arterien mit eiskaltem PBS aus, um Verunreinigungen und Blutrückstände zu entfernen.
Anmerkung: Wenn die Proben nicht sofort den nächsten Schritten unterzogen werden, frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C.
