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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
1. Vitrifizierung von Embryonen
- Führen Sie alle Manipulationen bei Raumtemperatur (ca. 22 °C) durch, um die Toxizität der Vitrifikationslösung bei wärmeren Temperaturen zu verringern.
Anmerkung: Embryonen können in diesem Protokoll mit einer automatischen Pipette von 0,1 bis 2 μl bewegt werden, aber andere ähnliche Geräte zum Bewegen der Embryonen mit dem minimalen Volumen können geeignet sein.
- Vitrifizieren Sie die Embryonen in einem zweistufigen Additionsverfahren:
- Legen Sie die Embryonen für 2 Minuten in eine Äquilibrierungslösung, die aus 10 % (v/v) Ethylenglykol und 10 % (v/v) Dimethylsulfoxid besteht, gelöst in Basismedium (BM). (Zusammensetzung von BM: Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (DPBS), ergänzt mit 0,2 % (w/v) Rinderserumalbumin)
- Die Embryonen (aus Schritt 1.2.1) werden 1 Minute lang in eine Vitrifikationslösung gebracht, die aus 20 % (v/v) Ethylenglykol und 20 % (v/v) Dimethylsulfoxid besteht, die in BM gelöst sind.
- Laden Sie die Embryonen in einen 0,25-ml-Kunststoffministraw (der ein geschlossenes Ende mit einem Wattestopfen und ein offenes Ende enthält). Der Prozess ist in Abbildung 1 schematisiert.
- Koppeln Sie das geschlossene Ende von 0,25 mL Ministraw mit dem entsprechenden Mikrodispenser (z. B. Captroll III).®
- BM bis zu 1/3 der Strohhalmlänge ansaugen, gefolgt von einer kleinen Luftblase.
- Aspirieren Sie die Embryonen in einem Volumen von 40 μl Vitrifikationslösung, gefolgt von einer weiteren kleinen Luftblase.
- BM wird aspiriert, bis die erste flüssige Fraktion (Schritt 1.3.2) die Watte erreicht.
- Das offene Ende mit einem Strohstopfen verschließen.
- Schritt 1.2.2 wird während Schritt 1.3 ausgeführt, um sicherzustellen, dass nicht mehr als eine Minute verstreicht, die für Embryonen giftig wäre.
- Tauchen Sie das Ministroh direkt in flüssigen Stickstoff, um eine Verglasung zu erreichen.
- Lagern Sie das Ministroh für die gewünschte Zeit in einem Dewar für Stickstoff.
