Embryotransfer in Kaninchen: ein Verfahren für den laparoskopiegesteuerten Transfer von Embryonen in den Eileiter eines ovulierenden weiblichen Kaninchenmodells

Zusammenfassung

Quelle: Garcia-Dominguez, X. et al., Minimalinvasiver Embryotransfer und Embryovitrifikation im optimalen Embryostadium im Kaninchenmodell. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video beschreibt die Technik des Transfers von Embryonen in den Eileiter eines empfangenden weiblichen Kaninchens mittels Laparoskopie. Es ermöglicht den Umbau des Embryos bei Kaninchen während seiner Wanderung durch den Eileiter und hilft schließlich bei der erfolgreichen Implantation. Diese Technik kann auch für gelagerte Embryonen mit guter Effizienz verwendet werden.

Protokoll

1. Embryotransfer

1. Vorbereitung der Empfängerinnen
   1. Verwenden Sie nur geschlechtsreife Weibchen (> 4,5 Monate alt).
   2. Eine Woche vor ET passen Sie die Weibchen an ein 16-stündiges helles/8-stündiges dunkles Regime an, um das Follikelwachstum zu initiieren und die weibliche Empfänglichkeit zu verbessern.
   3. Wählen Sie die Empfängerweibchen aus und beobachten Sie dabei die Prallheit und Farbe der Vulva. Ist die Vulva prall und rötlich, ist das Weibchen empfänglich.
   4. Induzieren Sie eine Pseudoschwangerschaft (Eisprung) durch eine einzige intramuskuläre Injektion von 1 μg Buserelinacetat (synthetisches Analogon des Gonadotropin-Releasing-Hormons), unabhängig vom Körpergewicht.
      HINWEIS: Normalerweise sind 0,8 μg eine geeignete Dosis für die Ovulationsinduktion bei mittelgroßen Kaninchen (4-5 kg), so dass 1 μg in der Regel den Eisprung garantiert.
   5. Induzieren Sie den Eisprung so viele Tage vor dem Alter der zu übertragenden Embryonen (z. B. 70-72 Stunden vor frischer Morula ET).
2. Anästhesie und Analgesie
   1. Wiegen Sie das Kaninchen und laden Sie die folgenden Anästhetika und Analgetika.
      1. In einer 1-ml-Spritze mit einer 30-g-Nadel: Xylazin (5 mg/kg) und Buprenorphinhydrochlorid (0,03 mg/kg) auffüllen. In eine weitere 1-ml-Spritze mit einer 23-G-Perikranialnadel wird Ketaminhydrochlorid (35 mg/kg) geladen.
   2. Halten Sie das Kaninchen fest und injizieren Sie das Xylazin-Buprenorphin-Gemisch intramuskulär.
   3. Führen Sie die perikranielle Nadel mit Ketamin in die marginale Ohrvene ein und führen Sie langsam den gesamten Spritzeninhalt intravenös ein.
   4. Fixieren Sie die Nadel und lassen Sie sie während der restlichen Schritte eingeführt, um bei Bedarf mehr Anästhesie zu verabreichen.
   5. Lassen Sie das Kaninchen im Käfig (sauber und ohne andere Tiere) auf einer warmen Bühne.
   6. Sobald Sie bewusstlos sind, tragen Sie Augensalbe auf, um Trockenheit des Auges zu vermeiden, und überprüfen Sie, ob der Lidreflex nicht vorhanden ist.
      Anmerkung: Dieses Protokoll sieht eine chirurgische Anästhesieebene für mindestens 30 Minuten vor. Wenn eine längere Zeit erforderlich ist, injizieren Sie nach 30 Minuten zusätzliche Dosierungen mit der Hälfte der in Abschnitt 1.2.1 beschriebenen Menge Ketaminhydrochlorid
   .
   7. Überwachen Sie die Narkosetiefe, indem Sie den Pedalreflex und die Atembewegung überprüfen. Veränderungen im Atemmuster zu einer unregelmäßigen und schnelleren Frequenz deuten auf einen Verlust der richtigen Anästhesieebene hin.
   8. Überwachen Sie die Farbe der Schleimhäute (Augen, Lippen usw.), die Atemfrequenz (30-60 Atemzüge pro Minute), die Herzfrequenz (120-325 Schläge pro Minute) und die Rektaltemperatur (38-39,6 °C).
   9. Halten Sie acht Stunden vor der Übertragung das Futter von den Tieren zurück, um eine größere Darmgröße und -aktivität zu vermeiden, bis der ET-Prozess abgeschlossen ist. Lassen Sie freien Zugang zu Wasser.
3. Vorbereitung des Embryos
   1. Erwärmen Sie das Embryomanipulationsmedium auf 25 °C: Basismedium (BM), bestehend aus Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS), ergänzt mit 0,2 % (w/v) Rinderserumalbumin.
   2. Spülen Sie unter einem Stereomikroskop frische oder aufgetaute (Schritt 2) Embryonen mit BM.
   3. Befestigen Sie mit sterilen Handschuhen einen entsprechend konfigurierten 17G-Epiduralkatheter an einer 1-ml-Spritze.
   4. Aspirieren Sie 1 cm BM in den Katheter, gefolgt von einer kleinen Luftblase.
   5. Aspirieren Sie 5-7 Embryonen in einem Volumen von 10 μl BM, gefolgt von einer weiteren kleinen Luftblase.
   6. Beenden Sie die Belastung des Katheters, indem Sie 1 cm BM aspirieren.
4. Embryotransfer
   1. Erwägen Sie die Verwendung von sterilen Handschuhen, Kitteln und Masken, um eine aseptische Umgebung zu gewährleisten.
   2. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente, reinigen Sie die Oberflächen, an denen die Operation durchgeführt wird, und wischen Sie sie mit 70 % Ethanol ab.
   3. Führen Sie die Anästhesie wie zuvor beschrieben (Schritt 1.2) durch und prüfen Sie, ob die Reflexe verloren gehen.
   4. Rasieren Sie das Fell vom Bauchbauch mit einem Elektrorasierer.
   5. Bereiten Sie den ventralen Bauch aseptisch vor.
      1. Reinigen Sie den Operationsbereich und entfernen Sie alle verbleibenden Haare. Waschen Sie den Operationsbereich mit einer Chlorhexidingluconat-Seife. Desinfizieren Sie den Bereich mit Chlorhexidinlösung und Ethanol 96º (3 mal).
   6. Legen Sie das Tier auf einen warmen Operationstisch in Trendelenburgs Position (Kopf nach unten bei 45°), um sicherzustellen, dass Magen und Darm kranial liegen. Ziehen Sie die Entleerung der Blase in Betracht, wenn sie prall ist. Wenn dabei Eingeweide beschädigt werden, kann das Tier sterben. Daher ist es wichtig, dass sie richtig platziert sind (Abbildung 1).
   7. Decken Sie den Bereich mit einem sterilen Handtuch mit einem Loch (Fensterung) ab, das den rasierten Bereich freilegt, um die Operationsstelle von potenziell kontaminierenden Bereichen zu trennen.
   8. Ein endoskopischer Trokar wird 5 cm tief in die Bauchhöhle eingeführt, 2 cm kaudal zum Processus xiphoideus, und durch diesen wird die Bauchhöhle mit einem druckregulierenden mechanischen Insufflator insuffliert.
      Anmerkung: Der intraabdominale Druck sollte 8-12 mmHg mit CO₂ betragen (Abbildung 1A).
   9. Führen Sie die Endoskopkamera durch den endoskopischen Trokar ein (Abbildung 1B).
      HINWEIS: Identifizieren Sie den Fortpflanzungstrakt und bestimmen Sie den Status und die Position des Infundibulums und der Ampulle vor der ET, um die nächsten Schritte zu erleichtern.
   10. Führen Sie die 17-G-Epiduralnadel in der Leistenregion zwischen 2 und 3 cm vom Infundibulum entfernt ein (Abbildung 1B).
   11. Identifizieren Sie den Eingang des Infundibulums (Abbildung 2A, 2B).
   12. Führen Sie den geladenen Katheter (Schritt 1.3) durch die Epiduralnadel in den Bauch ein (Abbildung 1C).
   13. Lokalisieren Sie den Eileiter und führen Sie 1-2 cm des Epiduralkatheters durch das Infundibulum in der Ampulle ein (Abbildung 2A-2C). Steigen Sie nicht sehr weit in den Eileiter ein, um Schäden und Blutungen zu vermeiden.
   14. Geben Sie die Embryonen in den Eileiter ab, indem Sie vorsichtig auf den Kolben der Spritze drücken, der mit dem Katheter gekoppelt ist (Abbildung 2D-2F). Beide Luftblasen müssen aus dem Katheter austreten.
   15. Entfernen Sie den Katheter kurz nachdem die Embryonen freigesetzt wurden.
   16. Spülen Sie den Katheter, saugen Sie das Manipulationsmedium ab und geben Sie es wieder ab, um das Fehlen der Embryonen zu überprüfen und ihren erfolgreichen Transfer zu bestätigen.
   17. Wiederholen Sie die Schritte 1.4.11 bis 1.4.16 auf der anderen Seite der Gebärmutter, falls gewünscht.
   18. Entfernen Sie die Epiduralnadel und die Endoskopkamera.
   19. Geben Sie CO₂ durch den endoskopischen Trokar ab. Wenn überschüssiges Gas im Bauch des Tieres verbleibt, wird es Schmerzen und Beschwerden haben.
   20. Entfernen Sie den endoskopischen Trokar aus der Bauchhöhle. Entfernen Sie das chirurgische Handtuch.
   21. Brechen Sie die Anästhesie ab.
   22. Reinigen Sie den Einschnitt des Trokars mit Chlorhexidinlösung. Verschließen Sie den Schnitt des Trokars mit einem mikronisierten Aluminium und einem Kunststoffverband.

Ergebnisse

Abbildung 1: Laparoskopischer Embryotransfer mit Hilfe der Laparoskopie (Außenansicht).A) Einführen des endoskopischen Trokars (ein Port). B) Einführen der endoskopischen Kamera und der Epiduralnadel (schwarzer Pfeil). C) Einführen des Embryotransferkatheters (weißer Pfeil) durch die Epiduralnadel.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rinderserumalbumin (BSA)	VWR	332
Buprenorphin-Hydrochlorid	Alvet Escartí	626	Von einem zugelassenen Tierarzt zu bestellen.
Buserelin Acetat	Sigma Aldrich	Nr. B3303
CO2-Ausstoß	Air Liquide	Artikel-Nr.: 99921	CO2 N48.
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Sigma Aldrich	Nr. D5773	Ohne Calciumchlorid
Elektrorasierer	Oster Golden A5	Artikel-Nr.: 078005-140-002
Kamera für Endoskop	Optomic Spain S.A	OP-714
Endoskop-Trokar mit Silikon-Segelventil	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	30114GK	Leichtes Trokarmodell.
Clorhexidin-Digluconat-Seife	Alvet Escartí	0265DCCJ500B
Epicraneale Nadel 23G	Alvet Escartí	514056353	Es können auch kleinere Nadeln verwendet werden.
Epiduraler Katheter	Unternehmen Vygon	187,1
Epidural-Nadel	Unternehmen Vygon	187,1
Augensalbe	Alvet Escartí	Artikel-Nr.: 5273
Laparoskopie-Ausrüstung	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	26003 AA	Hopkins® Laparoskop, 0º-mm-Laparoskop mit gerader Sichtweise, 30 cm Länge, 5 mm Arbeitskanal.
Lichtquelle	Optomic Spain S.A	Fibrolux 250
Mechanischer CO2-Insufflator	Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	Endoflator®
Silikonschlauch für Insufflato	r Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A.	20400040
stereomikroskop	Leica	MZ16F	Es gibt günstigere Optionen wie Leica MZ8 oder Nikon SMZ-10 oder SMZ-2B, um nur einige zu nennen.
Kaninchen	Universitat Politècnica de València	Linie A	Andere Mutterlinien, wie z.B. Linie V oder Linie HP, können verwendet werden.