Bead Loading zum Einbringen von Nukleinsäuren in adhärente kultivierte Zellen: Eine Technik zum Laden von fluoreszierenden Protein-kodierenden Plasmiden in adhärente Säugetierzellen

Zusammenfassung

Quelle: Cialek, C. A. et al. Bestückung von Proteinen und Nukleinsäuren in adhärente menschliche Zellen. J. Vis. Exp. (2021).

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren in adhärente Säugetierzellen mittels Bead-Loading.

Protokoll

>1. Raupen-Wägezellen

HINWEIS: Falls erforderlich, waschen Sie die Zellen kurz mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie dann 2 mL des optimalen Mediums hinzu. Mindestens 30 Minuten inkubieren.

1. Stellen Sie eine Lösung von 3-8 μl her, die die gewünschten Plasmide, Proteine und/oder Partikel enthält. Verwenden Sie ~1 μg (0,1-1 pmol) von jedem Plasmidtyp und ~0,5 μg (0,01 nmol) Protein, abhängig von den experimentellen Anforderungen. Verwenden Sie ein Röhrchen mit geringer Retention für Proteine, damit sie nicht an den Röhrchenwänden zurückbleiben. Bringen Sie die Lösung mit PBS auf ein Minimum von 3 μl und passen Sie das Lösungsvolumen so an, dass der gesamte Bereich der zu ladenden Zellen bedeckt ist (d. h. die Mikrovertiefung der Kammer, Abbildung 1B).
2. Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren und/oder das Röhrchen schnippen. Schleudere die Lösung kurz bis zum Boden des Röhrchens in einer Tischmikrofuge.
3. Übertragen Sie die Beladungslösung und die Zellkammer in eine Gewebekulturhaube. Führen Sie die restlichen Schritte in der Gewebekulturhaube mit steriler Technik durch.
4. Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und lagern Sie es vorübergehend in einem sterilen Röhrchen. Saugen Sie das gesamte Medium vorsichtig an den Rändern der Kammer an, kippen Sie die Kammer in einem Winkel von etwa 45° und entfernen Sie den restlichen Medientropfen aus der mittleren Mikrovertiefung. Achten Sie bei der Entnahme des Mediums darauf, dass die Pipettenspitze das Glas nicht berührt, da dies zu Zellablösung und Zellverlust führen kann. Gehen Sie schnell zum nächsten Schritt über, damit die Zellen nicht lange trocken sind.
5. Pipettieren Sie die Bead-Ladelösung vorsichtig auf die Glasmikrovertiefung in der Mitte der Kammer. Optional: Inkubieren Sie unter leichtem Schaukeln für ~30 s, ohne die Kammer vollständig austrocknen zu lassen.
6. Dispergieren Sie vorsichtig eine Monoschicht aus Glasperlen auf den Zellen, vorzugsweise unter Verwendung einer Bestückungsvorrichtung (Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass die Kügelchen die Zellen im Mikrotopf mit Glasboden vollständig bedecken.
7. Drücken Sie die Kammer mit zwei Fingern zusammen und klopfen Sie sie gegen die Oberfläche der Haube, indem Sie sie ~2 Zoll anheben und fest nach unten bringen. Wenden Sie eine Kraft an, die in etwa dem Herunterfallen der Schüssel aus dieser Höhe entspricht. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt ~10 Taps.
   Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die Zapfhähne die Zellen nicht wesentlich ablösen. Das Tippen kann für den Zelltyp optimiert werden. Wenn die Zellen schlecht geladen werden, klopfen Sie stärker. Wenn sich jedoch viele Zellen ablösen, klopfen Sie leichter darauf.
8. Geben Sie vorsichtig Medium zurück in die Kammer, indem Sie es langsam auf die Kunststoffseite der Kammer pipettieren. Versuchen Sie, alle schwebenden Kügelchen abzusaugen, ohne die Zellen zu stören. Fügen Sie in diesem Schritt weitere vorgewärmte Medien hinzu, wenn zu viel entfernt wurde. Inkubieren Sie die Zellen für 0,5-2 Stunden im Inkubator.

Ergebnisse

Abbildung 1: Raupenladevorrichtung, -technik und -zeitleiste

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10 cm Zellkulturschalen	VWR	Artikel-Nr.: 82050-916	Zur Kultivierung von Zellen verwenden
35 mm Zellkulturschalen	Falke	353001	Zur Konstruktion eines Wulstladers
Attofluor-Zellkammer	Thermo Fisher Scientific	Nr. A7816	Verwenden Sie diese Option, um den benutzerdefinierten Wulstlader zu konstruieren
DMEM, hoher Glukosegehalt, kein Glutamin	Thermo Fisher Scientific	11960069	Verwendung in der allgemeinen Zellkultur
Glasbodenschalen, 35 mm, #1,5, 14 mm Glas	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Keimzellen auf diese Kammern für die Bildgebung
Glasperlen, säuregewaschen, ≤106 μm	Millipore Sigma	Nr. G4649	Streuen Sie es auf die Zellen, um Plasmid-DNA und Proteine mit Perlen zu beladen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Thermo Fisher Scientific	AM9625	Funktionierender Bestand an sterilem 1X PBS
Phenolfreies DMEM	Thermo Fisher Scientific	31053036	Anwendung auf Zellen vor der Bildgebung
Opti-MEM, reduziertes Serummedium	Thermo Fisher Scientific	31985070	Optimales Medium für die Inkubation von Zellen vor dem Beladen der Raupe (optionaler Schritt)