>1. Neugeborene Mäuse mit rAAV9 bei P0,5-P2,5 durch subkutane Injektion behandeln.
<ol>
	<li>Füllen Sie eine Insulinspritze 29G1/2 mit einem Gewicht von 0,33 x 12,7 mm mit der rekombinanten Adeno-assoziierten Virus 9 (rAAV9)-Lösung vor. Achten Sie darauf, Luftblasen zu entfernen.</li>
	<li>Halten Sie den kryobetäubten Welpen mit Daumen und Zeigefinger in einer Hand. Wischen Sie vor der Injektion mit einem mit 70% Isopropylalkohol getränkten Tupfer über die hintere Haut des Welpen, um den sterilen Zustand zu erhalten. Führen Sie die Spritzennadel in einem Winkel von 5 bis 10° in die vorder-dorsale Unterhaut des Tieres ein. Injizieren Sie 50-70 μl der rAAV9-Lösung mit der Insulinspritze. 
	HINWEIS: rAAV9 kann der Maus auch durch intraperitoneale oder intravenöse Injektion verabreicht werden. Eine effiziente Expression der abgegebenen Gene im Herzen kann erreicht werden. Die intraperitoneale Injektion kann jedoch manchmal zu einer undichten Expression in der Leber führen. Nach der Injektion wurde der Zustand der Welpen jeden Tag überwacht.</li>
</ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="immer">
	<tbody>
		<tr>
			<td>rAAV9-Vektor </td>
			<td>Penn Vektor Kern </td>
			<td>Nr. 1967</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rekombinante adeno-assoziierte virusbasierte genverabgabung: eine technik für die transgene verabreichung und kardiospezifische expression im nagetiermodell

Recombinant Adeno Associated Virus Based Gene Delivery: A Technique for Transgene Delivery and Cardiac-Specific Expression in Rodent Model

Quelle: Ding, J. et al. <a href="https://www.jove.com/v/54787">Vorbereitung von rAAV9 zur Überexprimation oder zum Knockdown von Genen in Mäuseherzen.</a> J. Vis. Exp. (2016)
In diesem Video demonstrieren wir die rekombinante Adeno-assoziierte Virus-basierte Genabgabe im Maus-Welpen. Diese Methode hilft bei der Untersuchung der Genexpression in den Zielzellen.

Rekombinante Adeno-assoziierte virusbasierte Genverabgabung: Eine Technik für die transgene Verabreichung und kardiospezifische Expression im Nagetiermodell

Quelle: Ding, J. et al. Vorbereitung von rAAV9 zur Überexprimation oder Knockdown-Stimulation von Genen in Mäuseherzen. J. Vis. Exp. (2016)
In diesem Video zeigen wir ...

Das rekombinante Adeno-assoziierte Virus, rAAV, ist ein kleines, einzelsträngiges DNA-Virus, das gentechnisch so verändert wurde, dass es auf einen bestimmten Zelltyp abzielt und seine genetische Fracht zur Genexpression in den Zellkern der Wirtszelle transportiert.
Beginnen Sie damit, ein kryo-anästhesiertes Mausjunges zurückzuhalten. Sterilisieren Sie die Rückenhaut und injizieren Sie subkutan den rAAV-Vektor, der das gewünschte Transgen entlang eines herzspezifischen Promotors trägt. Der Vektor wird in das Gefäßsystem aufgenommen und erreicht entfernte Organe, einschließlich des Herzens.
Hier heftet sich das rekombinante Virus an die Oberfläche des Kardiomyozyten und wird über Endozytose in ein Endosom internalisiert. Innerhalb des Endosoms zerlegt sich das virale Kapsid teilweise und legt die viralen lytischen Proteine frei. Dieses Protein induziert Poren in der endosomalen Membran, durch die der Vektor in das Zytoplasma entweicht.
Der Vektor wandert durch zytoplasmatische Mikrotubuli und tritt durch die Kernpore ein. Im Zellkern zerlegt sich das virale Kapsid, um sein Genom freizusetzen. Die einzelsträngige DNA, die das Zielgen trägt, wird dann in doppelsträngige DNA umgewandelt.
Nach der DNA-Transkription wandert die produzierte mRNA in das Zytoplasma. Hier durchläuft die mRNA eine Translation, die das Zielprotein in den Kardiomyozyten exprimiert. Betrachten Sie Gewebeproben aus verschiedenen Organen unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die Effizienz und Gewebespezifität der Genabgabe an das Herz zu bestimmen.

Nach Bestimmung des Virustiters gemäß dem Textprotokoll werden rAAV9-Arbeitslösungen mit Virustitern von 1-7 x 1012 Partikeln pro Milliliter hergestellt. Zur Behandlung von neugeborenen Mäusen verwenden Sie die rAAV9-Lösung, um eine 0,33 x 12,7-Milliliter-Insulinspritze mit einer 29-Gauge-1/2-Zoll-Nadel vorzufüllen, um Luftblasen zu vermeiden.
Nachdem Sie einen Welpen kryoanästhesiert haben, halten Sie den Welpen mit Daumen und Zeigefinger in einer Hand. Wischen Sie dann mit einem mit 70%igem Isopropylalkohol getränkten Tupfer über die Rückenhaut des Welpen. Führen Sie die Spritzennadel in einem Winkel von 5 bis 10 Grad in die vorder-dorsale Unterhaut des Tieres ein, bevor Sie 50 bis 70 Mikroliter der rAAV9-Lösung injizieren.

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Biologische Techniken

Gene Transfer Techniques

Techniken des Gentransfers

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Transduktion

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Rekombinante Adeno-assoziierte virusbasierte Genverabgabung: Eine Technik für die transgene Verabreichung und kardiospezifische Expression im Nagetiermodell

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