Nanoblade-basierte Verabreichung von Nukleinsäurefracht: Eine Technik zur Verabreichung des Cas9-sgRNA-Komplexes an Zielzellen über virusähnliche Partikel

Zusammenfassung

Quelle: Mangeot, P. E., et al. Verabreichung des Cas9/sgRNA-Ribonukleoprotein-Komplexes in immortalisierte und primäre Zellen über virusähnliche Partikel ("Nanoblades"). J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Nanoblade-basierten Verabreichung des Cas9-sgRNA-Ribonukleoproteinkomplexes in Zielzellen für die Genom-Editierung. Nanoblades sind virusähnliche Partikel, die nicht in der Lage sind, sich zu vermehren und benachbarte Zellen zu infizieren, und daher sehr nützlich für den schnellen und dosisabhängigen Transport von Bio- und Nanomaterialien sind.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. sgRNA-Design und Klonierung

HINWEIS: Richtlinien für das Design von sgRNAs können aus verschiedenen Quellen wie https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing oder von Hanna und Doench bezogen werden.

1. Sobald die 20 Nukleotid-sgRNA-Sequenzen entworfen wurden, bestellen Sie die folgenden einzelsträngigen DNA-Oligonukleotide:
   1. Vorwärts: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N entspricht dem Ziellocus ohne die Protospacer-adjacent motif (PAM)-Sequenz)
   2. Rückwärts: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 3' (N entspricht dem umgekehrten Komplement des Ziellocus ohne PAM-Sequenz)
      Anmerkung: Bei der Bestellung der Oligonukleotide sind keine besonderen Modifikationen erforderlich (keine Anforderung für 5'-Phosphat).
2. Hybridisieren Sie die beiden DNA-Oligonukleotide in einem 0,2-ml-Polymerase-Kettenreaktionsröhrchen (PCR), indem Sie 5 μl Annealing-Puffer (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; pH 7,9 bei 25 °C), 1 μl jedes DNA-Oligonukleotids (100 μM Stammlösung in Wasser) und 42 μl Wasser mischen.
3. Inkubieren Sie die Proben auf einem PCR-Block 15 s lang bei 95 °C und senken Sie dann die Temperatur mit einer Rampe von 0,5 °C/s auf 20 °C. Bei Raumtemperatur aufbewahren oder bei -20 °C lagern.
   Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
4. Verdau von 10 μg der BLADE- oder SUPERBLADE-sgRNA-Expressionsplasmide mit 10 Einheiten des BsmBI-v2-Restriktionsenzyms für 3 h bei 55 °C in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 μl.
   Anmerkung: Der verdaute Vektor sollte ein DNA-Insert von ~1,9 kb und ein zweites DNA-Fragment von ~3,3 kb freisetzen.
5. Laden Sie die Restriktionsreaktion auf ein 1%iges Agarosegel, das mit 5 μg/ml Ethidiumbromid gefärbt wurde (oder eine sicherere alternative DNA-Gelfärbung).
   Anmerkung: Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung, wenn Sie mit Ethidiumbromid hantieren, das im Verdacht steht, genetische Defekte zu verursachen.
   1. Schneiden Sie auf einem ultravioletten (UV) Tisch mit einer Wellenlänge von 312 nm (um eine Beschädigung der DNA zu vermeiden) das 3,3 kb große DNA-Fragment aus dem Gel und legen Sie es in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
      HINWEIS: Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung (Handschuhe und UV-Schutzbrille), wenn Sie mit Ethidiumbromid hantieren und am UV-Tisch arbeiten.
   2. Extrahieren Sie DNA aus dem geschnittenen Gel, das das 3,3 kb DNA-Fragment enthält, mit einem speziellen DNA-Gel-Extraktionskit (siehe Materialtabelle). Quantifizieren Sie die Menge an gereinigter DNA mit einem Spektralphotometer.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
6. Ligamieren Sie die hybridisierten vorwärts und reverse DNA-Oligonukleotide aus Schritt 1.2 auf den BsmB1-verdauten, gelgereinigten BLADES- oder SUPERBLADE-Vektor aus Schritt 1.5.2. Fügen Sie dazu 2 μl T4-DNA-Ligase-Puffer, 50 ng des gelgereinigten Vektors (aus Schritt 1.5.2), 1 μl der hybridisierten DNA-Oligonukleotide (aus Schritt 1.2), Wasser hinzu, um das Volumen auf 19 μl zu erhöhen, und 1 μl T4-DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Reaktion 10 Minuten lang bei 25 °C.
   1. Verwandeln Sie das Ligationsprodukt in kompetente Bakterien (siehe Materialtabelle). Die transformierten Bakterien werden auf eine Ampicillin-Luria-Bertani-Agarplatte aufgetragen und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
   2. Wählen Sie mehrere isolierte Kolonien auf der Agarplatte aus, um eine DNA-Minipräparation durchzuführen (siehe Materialtabelle), und führen Sie die Sanger-Sequenzierung mit einem U6-Forward-Primer (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') durch, um die korrekte Ligation der variablen sgRNA-Sequenz zu überprüfen.
      HINWEIS: Andere sgRNA-Expressionsplasmide können verwendet werden, wenn sie nicht für das Cas9-Protein kodieren, was die Nanoblade-Produktion beeinträchtigen könnte.

>2. Plasmid-Vorbereitung

1. Führen Sie eine maximale Vorbereitung (siehe Materialtabelle) aller erforderlichen Plasmide durch und bereiten Sie 10 μg Aliquots bei 1 μg/ml für die Lagerung bei -20 °C vor. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-/Auftauzyklen der Plasmide; verwenden Sie Aliquote zweimal, bevor Sie sie verwerfen.

3. Vorbereitung der Nanoklinge

1. An Tag 1 werden zwischen 3,5 und 4 × 10⁶ HEK293T Zellen (siehe Materialtabelle) in 10 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, Natriumpyruvat, L-Glutamin, 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und Penicillin/Streptomycin in einer 10 cm großen Zellkulturschale ausgesät. Bewegen Sie die 10 cm Platte vorsichtig hin und her, dann von rechts nach links (wiederholen Sie diese Sequenz 5x), um die Zellen gleichmäßig über die Kulturschale zu verteilen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem Zellinkubator mit 5 % CO₂,
   Anmerkung: Alle Verfahren im Zusammenhang mit dem Umgang mit kultivierten Zellen und Nanoblades sollten unter einer Laminar-Flow-Haube der Zellkultur durchgeführt werden, um deren Kontamination zu vermeiden.
2. Tag 2: Plasmid-Transfektion
   1. Die Zellen sollten 24 h nach der Beschichtung zu 70-80 % konfluent sein (Abbildung 1A). Ersetzen Sie das Medium vor der Transfektion durch 10 ml frisches DMEM><, das einen hohen Glukosegehalt, Natriumpyruvat, L-Glutamin und 10 % FBS enthält (Penicillin und Streptomycin können weggelassen werden, obwohl dies nicht obligatorisch ist). HINWEIS: Bei diesem Schritt ist es wichtig, dass die Zellen nicht zusammenfließen. Andernfalls könnten sowohl die Transfektionseffizienz als auch die Partikelproduktion reduziert werden.
   2. Bereiten Sie für jede 10-cm-Platte die folgenden Mengen an Plasmiden in einem 1,5-ml-Röhrchen vor: 0,3 μg pCMV-VSV-G, 0,7 μg pBaEVRless, 2,7 μg MLV Gag/Pol, 1,7 μg BIC-Gag-Cas9, 4,4 μg BLADES- oder SUPERBLADES-Plasmid, das für die klonierte sgRNA kodiert (oder jeweils 2,2 μg bei Verwendung von zwei sgRNAs).
   3. Fügen Sie 500 μl Transfektionspuffer hinzu (siehe Materialtabelle), wirbeln Sie 10 s lang vor und zentrifugieren Sie dann 1 s lang. Fügen Sie 20 μl des Transfektionsreagenzes hinzu (siehe Materialtabelle), wirbeln Sie das Röhrchen 1 s lang vor und zentrifugieren Sie dann 1 s lang.
   4. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und die gesamte Lösung mit einer P1000-Pipette tropfenweise in die Zellen im DMEM-Medium geben. Bewegen Sie die 10 cm Platte vorsichtig hin und her, dann von rechts nach links (wiederholen Sie diese Sequenz 5x), um das Transfektionsreagenz gleichmäßig über die Zellen zu verteilen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für mindestens 40 h in einem Zellinkubator mit 5 % CO₂,
      Anmerkung: Auf Wunsch kann das Medium 4 h nach der Transfektion gewechselt werden.
3. Überprüfen Sie an Tag 3 die Morphologie der transfizierten Zellen unter dem Mikroskop.
   Anmerkung: Die Produzentenzellen beginnen zu verschmelzen. Dies ist ein normales Ereignis, das auf die Expression fusogener Virushüllen zurückzuführen ist (Abbildung 1B,C).
4. Tag 4: Ernte von Nanoklingen
   Anmerkung: Mindestens 40 h nach der Transfektion wären die Zellen aufgrund der Expression der fusogenen Virushüllen miteinander verschmolzen, und manchmal sind die Zellen vollständig von der Plattenhalterung gelöst (Abbildung 1D).
   1. 9 ml des Überstands des Nährmediums werden mit einer 10-ml-Pipette aufgefangen.
      Anmerkung: Nanoblades sind VLPs, die in der Lage sind, das Cas9-Protein und die zugehörige sgRNA in Primärzellen und in vivo zu transportieren. Obwohl sie nicht als gentechnisch veränderte Organismen gelten, da sie kein genetisches Material enthalten, können sie genetische Veränderungen hervorrufen. Daher müssen sie mit Vorsicht manipuliert werden, um jeglichen Kontakt mit Benutzern zu vermeiden (insbesondere wenn sie so programmiert sind, dass sie auf Tumorsuppressorgene abzielen). Den Anwendern wird empfohlen, bei der Vorbereitung von VLPs und der Durchführung von Transduktionsexperimenten die lokalen Sicherheitsrichtlinien für die Manipulation retroviraler Vektoren zu befolgen und in einem BSL-2-Labor zu arbeiten. Nanoblades können mit 70 % Ethanol oder 0,5 % Natriumhypochlorit inaktiviert werden. Es ist auch ratsam, alle Kunststoffabfälle (Pipettenspitzen, Gewebekulturplatten, Zentrifugationsröhrchen) mindestens 10 min lang mit 0,5% Natriumhypochlorit zu behandeln, um die Nanoblades zu inaktivieren.
   2. Der gesammelte Überstand wird 5 Minuten lang bei 500 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen und den Überstand zurückzugewinnen, ohne das Zellpellet zu stören.
      HINWEIS: Wenn Nanoblades für die Verwendung auf Primärzellen vorgesehen sind, filtern Sie den Überstand mit einem 0,45 μm oder 0,8 μm Filter. Beachten Sie, dass dieser Schritt den Nanoblade-Titer drastisch reduziert, da ein erheblicher Teil in der Filtermembran blockiert wird.
   3. Pelletieren Sie die Nanoblades über Nacht (12-16 h) in einem schwingenden Schaufelrotor bei 4.300 × g oder bei 209.490 × g in einer Ultrazentrifuge für 75 min bei 4 °C (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Wenn Zielzellen in DMEM wachsen können, ist es möglich, sie direkt mit dem nach Schritt 3.4.2 erhaltenen Überstand zu inkubieren, ohne die Nanoklingen zu konzentrieren.
5. Tag 5: Resuspension und Lagerung von Nanoblades
   1. Nach der Zentrifugation das Medium langsam ansaugen und das weiße Pellet mit 100 μl kalter 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendieren. Das Röhrchen mit Parafilm abdecken und 1 h bei 4 °C unter leichtem Rühren inkubieren, bevor das Pellet durch Auf- und Abpipettieren wieder aufgewirbelt wird.
      Anmerkung: Bei der Resuspension kann ein weißes viskoses Material entstehen; Dies ist normal und hat keinen wesentlichen Einfluss auf die Effizienz der Transduktion.
   2. Lagern Sie die Nanoblades bei 4 °C, wenn Sie sie innerhalb von vier Wochen verwenden möchten. Andernfalls frieren Sie die Nanoblades in flüssigem Stickstoff ein und lagern sie bei -80 °C.
      HINWEIS: Tragen Sie eine Schutzbrille und kryogene Handschuhe, wenn Sie mit flüssigem Stickstoff hantieren. Das Schockfrosten und die Lagerung bei -80 °C führen zu einer deutlichen Verringerung der Nanoblade-Effizienz. Außerdem sollten aufgetaute Nanoblades nicht wieder eingefroren werden. Das Protokoll kann hier pausiert werden.

>4. Konzentration von Nanoklingen auf einem Saccharose-Kissen

HINWEIS: Als Alternative zur Nachtzentrifugation oder Ultrazentrifugation (Schritt 3.4.3) können die Nanoblades auf einem Saccharosekissen konzentriert werden. Dies ergibt eine reinere Fraktion von Nanoblades, obwohl die Gesamtmenge der zurückgewonnenen Nanoklingen geringer ist.

1. Bereiten Sie eine 10%ige Saccharoselösung (Gewicht zu Volumen) in 1x PBS vor und filtrieren Sie sie durch einen 0,2 μm Spritzenvorsatzfilter (siehe Materialtabelle).
2. Beginnen Sie mit der Konzentration der Nanoblades auf dem Saccharosekissen.
   1. 9 mL der VLP-haltigen Probe (aus Schritt 3.4.3) werden in ein Ultrazentrifugenröhrchen gegeben (siehe Materialtabelle). Mit einer 3-ml-Spritze und einer Kanüle langsam 2,5 ml der 10%igen Saccharose unter die Probe legen und dabei versuchen, die VLP-haltige Probe und die Saccharoselösung nicht zu vermischen.
   2. Alternativ können Sie 2,5 mL 10%ige Saccharose in ein Ultrazentrifugenröhrchen geben (siehe Materialtabelle). Kippen Sie das Röhrchen und fügen Sie die 9 mL VLP-haltige Probe (aus Schritt 3.4.3) langsam mit einer Pipettorin mit niedriger Geschwindigkeit hinzu. Heben Sie das Rohr während dieses Vorgangs schrittweise in eine vertikale Position an.
3. Die Proben werden bei 209.490 × g in einer Ultrazentrifuge für 90 min bei 4 °C zentrifugiert.
   Anmerkung: Diese Technik kann über Nacht für die Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit (4.300 × g) angepasst werden.
4. Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren vorsichtig den Überstand und legen Sie das Röhrchen kopfüber auf Seidenpapier, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen. Nach 1 min 100 μl 1x PBS zugeben und das Röhrchen bei 4 °C mit einer Parafilmabdeckung in einem Röhrchenhalter für 1 h auf einen Rührtisch legen (siehe Materialtabelle), bevor das Pellet durch Auf- und Abpipettieren wieder aufgewirbelt wird.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

>5. Überwachung der Cas9-Beladung in Nanoblades mittels Dot-Blot

1. Bereiten Sie den Verdünnungspuffer vor, indem Sie 1 Volumen Lysepuffer hinzufügen, der ein nichtionisches Tensid enthält (siehe Materialtabelle) in 4 Volumina mit 1x PBS. 2 μl konzentrierte Nanoblades in 50 μl Verdünnungspuffer verdünnen, kurz vortexen und 25 μl dieser Mischung in ein neues Röhrchen mit 25 μl Verdünnungspuffer überführen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um 4 Röhrchen Nanoblade-Verdünnungen zu erhalten (2-fache Verdünnungsschritte).
2. Für die Standardkontrollen verdünnen Sie 2 μl rekombinante Cas9-Nuklease (siehe Materialtabelle) in 50 μl Verdünnungspuffer, wirbeln Sie kurz vor und fahren Sie mit acht seriellen Verdünnungen fort (2-fache Verdünnung für jeden Schritt).
3. 2,5 μl jeder VLP-Verdünnung und 2,5 μl jedes Standards mit einer Mehrkanalpipette vorsichtig auf eine Nitrozellulosemembran aufsprühen (ein größeres Volumen kann zu überlappenden Flecken führen).
   Anmerkung: Eine mit Methanol behandelte Polyvinyldifluoridmembran kann ebenfalls verwendet werden.
4. Sobald die Partikel auf der Membran absorbiert sind, verstopfen Sie die Membran mit 1x Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die ein nichtionisches Tensid (TBS-T) enthält, das mit fettfreier Trockenmilch (5 % w/v) für 45 min bei Raumtemperatur ergänzt wird.
   Anmerkung: Hier kann das Protokoll pausiert und die Membran bei 4 °C in 1x TBS-T gelagert werden.
5. Entsorgen Sie das 1x TBST, das mit fettfreier Trockenmilch ergänzt wurde, und inkubieren Sie die Membran über Nacht bei 4 °C mit dem Cas9-Meerrettichperoxidase-Antikörper (1/1000 Verdünnung in 1x TBST, 5% Milch). Waschen Sie die Membran 3x mit TBS-T und visualisieren Sie das Signal mit einem verbesserten Chemilumineszenz-Substratkit.
6. Quantifizieren Sie die Punktintensität für die Nanoblades und rekombinanten Cas9-Standardverdünnungen mit der proprietären Software, die mit der Gel-Imaging-Station oder imageJ geliefert wird. Definieren Sie eine lineare Kurve, die die Punktintensität mit der Cas9-Konzentration verbindet. Extrapolieren Sie mit der Funktion der erhaltenen Kurve den Cas9-Gehalt in jeder Zubereitung.
   Anmerkung: Die Menge an rekombinanter Cas9-Proteinkontrolle kann den Messwert für die am stärksten konzentrierten Proben des Standardverdünnungssets sättigen (Abbildung 2). Es wird daher empfohlen, bei der Definition der linearen Kurve den Messwert der unverdünnten Proben (und manchmal den der ersten Verdünnungsschritte) zu entfernen, wenn sie nicht im linearen Bereich in Bezug auf die bekannte Konzentration von Cas9 liegen, die entdeckt wurde. Analog dazu sollten bei der Extrapolation der Cas9-Menge in den Nanoblade-Proben nur die Messwerte verwendet werden, die innerhalb des linearen Bereichs der Standardkurve liegen.

>6. Transduktion von Zielzellen mit Nanoblades (Verfahren zur Transduktion in einer 12-Well-Platte)

1. In einer 12-Well-Platte werden 100.000 bis 200.000 Zellen (entweder primäre oder immortalisierte adhärente Zellen) pro Well in 1 ml des entsprechenden Zellkulturmediums ausgesät. Lassen Sie die Zellen vor der Transduktion an der Plattenoberfläche anhaften.
2. In ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen geben Sie 5-20 μl konzentrierte Nanoklingen (aus Schritt 3.5.1 oder 4.4) zu 500 μl Zellkulturmedium und mischen Sie, indem Sie mit einer P1000-Pipettorin auf und ab pipettieren. Entfernen Sie das Medium aus den Zellen und ersetzen Sie es durch die 500 μl dieser Nanoblade-Mischung.
   Anmerkung: Die Transduktion muss für jeden Zelltyp optimiert werden. Es ist wichtig, ein möglichst kleines Volumen des Mediums zu verwenden (und gleichzeitig ein Austrocknen der Zielzellen zu vermeiden), damit die Nanoblades hochkonzentriert bleiben. Adhärente Zellen müssen direkt transduziert werden, während sie an der Platte befestigt sind (nicht in Suspension transduzieren, da dies die Transduktionseffizienz erheblich verringert). Einige Zellen vertragen eine längere Exposition gegenüber Nanoblades (24-48 h), während andere sehr empfindlich sind und kleine Synzytien bilden können. In diesem Fall müssen Nanoblades nur 4-6 Stunden mit Zellen inkubiert werden, bevor das Medium ausgetauscht wird. Die Spinokulation kann auch die Transduktion von Zellen verbessern, die in Suspension gezüchtet werden. Adjuvantien wie kationische Polymere (siehe Materialtabelle) können die Transduktionseffizienz in einigen Zelltypen ebenfalls verbessern.
3. Nach 4-6 Stunden Zellinkubation in einem geringen Volumen des Mediums, das Nanoblades enthält, erhöhen Sie das Volumen des Mediums auf die normale Menge (1 mL, wenn Sie mit einer 12-Well-Platte arbeiten) oder ersetzen Sie es durch frisches Medium, wenn die Zellen empfindlich auf VLPs reagieren.
   Anmerkung: Zellmedium, das Nanoblades enthält, muss 10 Minuten lang mit 0,5 % Natriumhypochlorit inaktiviert werden, bevor es verworfen wird. Verwenden Sie Handschuhe und eine Schutzbrille, wenn Sie Natriumhypochlorit manipulieren. Wenn Nanoblades den Zelltod induzieren, passen Sie die Menge und die Gesamtzeit der Exposition an, um die Zellsterblichkeit zu reduzieren.

Ergebnisse

Abbildung 1: Morphologie der Produzentenzellen während der Nanoblade-Produktion.(A) HEK293T Zellen bei 70-80 % Konfluenz 24 Stunden nach der Beschichtung. (B und C) HEK293T Zellmorphologie 24 h nach der Transfektion. (D) HEK293T Zellmorphologie 40 h nach der Transfektion. Maßstabsleisten = 400 μm.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
13,2 mL, dünnwandige Polypropylen-Röhrchen, 14 x 89 mm - 50Pk	Beckman Coulter Biowissenschaften	331372	Ultrazentrifugationsröhrchen für die Reinigung von Nanoblades
Amersham Protran Premium Western Blotting-Membranen, Nitrozellulose	Merck	GE10600004	Nitrozellulosemembran zur Quantifizierung des Cas9-Gehalts in gereinigten Nanoblades
BIC-Gag-CAS9	Addgene	119942	Kodiert eine GAG (F-MLV)-CAS9(SP)-Fusion. Ermöglicht die Produktion von GAG-CAS9-Virus-ähnlichen Partikeln aus Produzentenzellen in Verbindung mit überexprimierten gRNA(s) und geeigneten Hüllkurven
BICstim-Gag-dCAS9-VPR	Addgene	120922	Kodiert eine GAG-dCAS9-VPR-Fusion für eine gezielte transkriptionelle Aktivierung
Klinge	Addgene	134912	Leeres Rückgrat für die Klonierung der sgRNA-Sequenz für den Einsatz im Nanoblades-System
BsmBI-v2	Neuengland Biolabore	R0739S	Restriktionsenzym zur Verdauung der BLADE- und SUPERBLADES-Vektoren für die sgRNA-Klonierung
Cas9 (7A9-3A3) Maus mAb (HRP-Konjugat) #97982	Zell-Signaltechnik	97982S	Anti-Cas9-Antikörper für die Cas9-Quantifizierung mittels Dot-Blot
Cas9-Nuklease, S. pyogenes	Neuengland Biolabore	M0386T	Rekombinantes Cas9-Protein, das als Referenz für die absolute Quantifizierung der Menge an Cas9 verwendet werden soll, die in Nanoblades geladen
Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml in H2O)	Sigma-Aldrich	E1510-10ML	Zum Färben von Agarose-Gelen und zur Visualisierung von DNA
Fisherbrand Wave Motion Shaker	Fisher Scientific	Tel.: 88-861-028	Rührtisch zur Resuspendierung von Nanoblades nach dem Zentrifugieren
gelAnalysator			http://www.gelanalyzer.com; Quantifizierung der Bandenintensität nach dem Aufschluss
Gesikel-Produzent 293T	Takara	632617	Zelllinie des Herstellers von Nanoblades
Gibco DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat	ThermoFisher Scientific	41966052	Zellkulturmedium für Gesicle Producer 293T Zellen
jetPRIME Transfektionsreagenzkit für DNA und DNA/siRNA	Polyplus	POL114-15	Transfektionsreagenz für die Nanoblade-Produktion in Gesicle Producer 293T-Zellen
Millex-AA, 0,80 μm, Spritzenvorsatzfilter	Millipore	SLAA033SS	Spritzenvorsatzfilter zur Entfernung von Zelltrümmern vor der Konzentration von Nanoklingen
Millex-GS, 0,22 μm, Spritzenvorsatzfilter	Millipore	SLGS033SS	Spritzenvorsatzfilter zur Sterilisation der Saccharose-Polsterlösung
Millex-HP, 0,45 μm, Polyethersulfon, Spritzenvorsatzfilter	Millipore	SLHP033RS	Spritzenvorsatzfilter zur Entfernung von Zelltrümmern vor der Konzentration der Nanoblades
Monarch DNA-Gel-Extraktionskit	Neuengland Biolabore	T1020L	DNA-Gel-Extraktionskit zur Aufreinigung des pBLADES- oder pSUPERBLADES-Plasmidfragments nach dem Verdau mit BsmBI
NEB stabil kompetente E. coli (hohe Effizienz)	Neuengland Biolabore	C3040I	Kompetente Bakterien für die Plasmidtransformation und -amplifikation
NucleoBond Xtra Midi-Kit für Plasmid-DNA in Transfektionsqualität	Macherey-Nagel	Artikel-Nr.: 740410.5	Maxi-Vorbereitungskit für die Aufreinigung von Plasmid-DNA aus kultivierten Bakterien
Nukleospin gDNA-Extraktionskit	Macherey-Nagel	Artikel-Nr.: 740952.5	Extraktion genomischer DNA aus transduzierten Zellen
NucleoSpin Plasmid, Mini-Kit für Plasmid-DNA	Macherey-Nagel	Artikel-Nr.: 740588.5	Mini-Präparationskit für die Aufreinigung von Plasmid-DNA aus kultivierten Bakterien
NucleoSpin Tissue, Mini-Kit für DNA aus Zellen und Gewebe	Macherey-Nagel	Artikel-Nr.: 740952.5	Kit zur Extraktion genomischer DNA
Optima XE-90	Beckman Coulter Biowissenschaften	Nr. A94471	Ultrazentrifuge
pBaEVRohne	Els Verhoeyen (Inserm U1111)	Persönliche Anfragen sind an folgende Adresse zu richten: els.verhoyen@ens-lyon.fr	Pavian-Endogenes Retrovirus-Rless-Glykoprotein, beschrieben in Girard-Gagnepain, A. et al. Pavianhüllen-pseudotypisierte LVs übertreffen VSV-G-LVs beim Gentransfer in frühzytokinstimulierte und ruhende HSCs. Blut 124, 1221–1231 (2014)
pBS-CMV-gagpol	Addgene	Artikel-Nr.: 35614	Enoziert den Maus-Leukämie-Virus-Gag und die Pol-Gene
pCMV-VSV-G	Addgene	Nr. 8454	Hüllprotein zur Herstellung von lentiviralen und MuLV-retroviralen Partikeln
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	ThermoFisher Scientific	14200091	10X PBS zum Verdünnen in Millipore-Wasser
Polybrene Transfektionsreagenz	Millipore Sigma	TR-1003-G	Kationisches Polymer, das die Effizienz der retroviralen Transduktion in bestimmten Säugetierzellen erhöht. Es kann auch den virusabhängigen Eintritt eines Oligodesoxynukleotids (ODN) für die homologiegerichtete Reparatur ermöglichen
Saccharose, für die Molekularbiologie, ≥99,5 % (GC)	Sigma-Aldrich	Nr. S0389-5KG	Saccharose zur Vorbereitung eines Polsters für die Aufreinigung von Nanoklingen durch Ultrazentrifugation
SUPERBLADE5	Addgene	134913	Leeres Rückgrat für die Klonierung von sgRNA-Sequenzen zur Verwendung in Nanoblades-Systemen (Optimiert für eine erhöhte Effizienz der Genomeditierung über Chen B et al., 2013)
SuperSignal West Dura Substrat mit verlängerter Dauer	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 34076	Enhanced Chemiluminescence (ECL) HRP-Substrat für Cas9-Dot-Blots
SW 41 Ti Ausschwingrotor	Beckman Coulter Biowissenschaften	331362	Rotor für die Ultrazentrifugation
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher Scientific	Nr. S33102	Alternative zu Ethidiumbromid zur Färbung von Agarose-Gelen und zur Visualisierung von DNA
T4-DNA-Ligase	Neuengland Biolabore	M0202S	DNA-Ligase zur Ligation der BLADE- oder SUPERBLADES-Vektoren mit den duplexierten DNA-Oligos, die der variablen Region der sgRNA entsprechen
Triton-haltiger Lysepuffer	Promega	E291A	Lysepuffer zur Unterbrechung von Nanoblades und zur Quantifizierung von Cas9
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	Nr. P9416	Für die Zubereitung von TBST

ist