Mikroinjektion von Mückenembryonen: Eine Technik zur Verabreichung exogener DNA in das Eigelb des Embryos von Anopheles gambiae, um Keimbahnmutationen zu erzeugen

Zusammenfassung

Quelle: Carballar-Lejarazú, R. et al, Mikroinjektionsmethode für Anopheles gambiae Embryonen. J. Vis. (2021).

In diesem Video demonstrieren wir die Verabreichung des Gene-Drive-Konstrukts in den Embryo der Anopheles gambiae Mücke durch die Mikroinjektionstechnik des Embryos. Dieses Verfahren ermöglicht die Integration des gelieferten DNA-Konstrukts durch homologe Rekombination in die Keimbahnzellen, um eine transformierte Mückenpopulation zu erzeugen.

Protokoll

>1. Mikroinjektion von Embryonen

1. Verwenden Sie eine Mikroladerspitze, um die Nadeln mit 2 μl DNA-Gemisch (Plasmid-DNA in einer Konzentration von 300-400 ng/μl) zu füllen. Führen Sie die Nadel in den Nadelhalter ein und schließen Sie den Schlauch der automatischen Druckpumpe an (Abbildung 1).
2. Wichtig: Richten Sie die Nadel so aus, dass sie einen Winkel von 15° zur Ebene des Schlittens bildet (Abbildung 1).
3. Öffnen Sie die Nadelspitze, indem Sie vorsichtig das erste Ei der Anopheles gambiae-Mücke berühren, und injizieren Sie es, indem Sie die Spitze der Nadel ≤ 10 μm in den hinteren Pol einführen. Eine erfolgreiche Injektion führt zu einer kleinen Bewegung des Zytoplasmas innerhalb der Eizelle.
4. Verwenden Sie die koaxialen Tischsteuerungen des Mikroskops, um zum nächsten Ei zu gelangen und die Injektion fortzusetzen.
   1. Um sicherzustellen, dass die Nadelspitze offen bleibt und nicht verstopft ist, drücken Sie die Injektionstaste, bevor Sie in einen anderen Embryo eindringen, und visualisieren Sie das kleine Tröpfchen an der Öffnung der Nadel.
   2. Wenn die Nadel verstopft ist, drücken Sie die Clear-Taste, um die Nadel zu reinigen, und wiederholen Sie den Tröpfchen-Visualisierungstest. Passen Sie den Druck nach Bedarf an, wenn die Öffnung der Nadelspitze etwas größer wird, um sicherzustellen, dass die Größe des Tröpfchens klein bleibt.
   3. Injizieren Sie ~40-50 Eier mit einer Nadel.
      Anmerkung: Achten Sie darauf, dass das Filterpapier immer feucht bleibt. Halten Sie ausreichend Gegendruck auf die Nadel, um sie frei zu halten. Eine Nadel, die nicht verstopft werden kann, muss durch eine neue Nadel ersetzt werden. Die Platzierung des Embryos, das Einführen der Nadel und die Injektion werden durch Mikroskope erleichtert, die über koaxiale Steuerungen für die horizontale Bewegung des Tisches verfügen (Abbildung 2).
5. Spülen Sie die Eier nach Abschluss der Injektionen in einen mit Filterpapier ausgelegten und mit 50 ml deionisiertem H2O gefüllten Glasbehälter ab (Abbildung 3).
   Anmerkung: Die Embryonen beginnen 2 Tage nach der Injektion zu schlüpfen und können bis zu 3-5 Tage dauern. Die geschlüpften Larven des ersten Stadiums müssen sofort (2 Mal täglich kontrollieren) in einen sauberen Behälter mit Wasser und Futter umgefüllt werden.

Ergebnisse

Abbildung 1: Nadelposition während der Mikroinjektionen. A) Weitwinkelansicht der Einspritzstufe. B,C) Positionieren Sie die Nadel so, dass die ausgerichteten Embryonen mit der Injektionsnadel einen Winkel von 15° bilden. Heben Sie den Arm des Mikroinjektionsinstruments, der die Nadel hält, nicht deutlich höher als den Mikroskoptisch an, um eine korrekte Winkelung zwischen der Nad...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10x Mikroinjektions-Puffer	-	-	1 mM NaHPO4-Puffer, pH 6,8, 50 mM KCl
Blotting-Membran (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)	Bio-Rad		Sauber und gerade in ein 2x1 cm großes Stück schneiden
Deionisiertes oder doppelt destilliertes Wasser (ddH20)	Mili-Q		In einer Waschflasche
Präpariermikroskop	Leica	Leica MZ12	Für die Ausrichtung des Embryos
Glasbehälter	Pyrex	Nr. 3140	125 x 65
Glas-Rutsche	Die Marke Fisher	Nr. 12-549-3	75x26 mm
Mikroinjektor	Sutter-Instrument		XenoWorks Digitaler Mikroinjektor
Microloader-Pipettenspitzen	Eppendorf		20 μL Microloader epT.I.P.S.
Mikromanipulator	Sutter-Instrument		XenoWorks Mikromanipulator
Mikropipette	Rainin		ca. 20 μl
Mikroskop	Leica	DM 1000 LED oder M165 FC	Für Mikroinjektion
Nylon-Mesh
Pinsel	Blick	Nr. 05831-7040	Fein, Gr. 4/0
Petrischale			Kunststoff, (60x15 mm, 90x15 mm)