Hydrodynamischer Gentransfer: Eine Technik zur In-vivo-Transfektion von exogener DNA in murinen Hepatozyten durch Injektion von Schwanzvenen

Zusammenfassung

Quelle: Hübner, E. K. et al., Konstitutive und induzierbare Systeme für die genetische In-vivo-Modifikation von Maus-Hepatozyten durch hydrodynamische Schwanzveneninjektion. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video beschreibt die Technik der genetischen in vivo Transfektion von murinen Hepatozyten durch hydrodynamische Schwanzveneninjektion. Dieses Transfektionssystem erzeugt eine langfristige Expression des Transgens in den Hepatozyten.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung der Lösung für die hydrodynamische Schwanzveneninjektion

HINWEIS: Bereiten Sie die Plasmidkonstrukte für die konstitutive und induzierbare Genexpression durch Klonierungstechnik unter Verwendung kompetenter Bakterien vor.

1. Bereiten Sie sterile 0,9%ige Kochsalzlösung für die Injektion vor (verwenden Sie kein PBS). Verwenden Sie ein Volumen, das etwa 10% des Körpergewichts der Maus entspricht. Beispiel: Bereiten Sie für eine Maus mit einem Gewicht von 20 g 2 ml Lösung vor.
2. Bereiten Sie Injektionsvektoren vor, die mit einem endotoxinfreien Plasmid-Aufreinigungskit gereinigt wurden.
3. Fügen Sie 10 μg oder 15 μg endotoxinfreies Dornröschen-Vektorkonstrukt hinzu (verwenden Sie 10 μg, ab Schritt 4 verwenden Sie jeweils 15 μg) und 1 μg endotoxinfreies pc-HSB5 pro mL steriler Kochsalzlösung.
4. Lösung bis zu 4 h bei 4 °C lagern. Nicht einfrieren.

>2. Durchführung einer hydrodynamischen Schwanzveneninjektion

1. Verwenden Sie einen Fixer für die Injektion von Schwanzvenen (kommerziell oder hergestellt aus einem konischen 50-ml-Schlauch mit Löchern für die Atmung und für den Schwanz). Füllen Sie den Boden der Tube mit Seidenpapier.
2. Verwenden Sie zur Injektion Mäuse im Alter von etwa 8 bis 10 Wochen mit einem Gewicht von 20 bis 25 g.
3. Wiegen Sie die Mäuse vor der Injektion und bereiten Sie das Injektionsvolumen entsprechend dem Körpergewicht vor (entspricht 10 % des Körpergewichts). Bereiten Sie eine sterile 3 mL-Spritze mit einer 27 G-Nadel für die Injektion vor und füllen Sie sie mit dem erforderlichen Volumen.
4. Setzen Sie die Maus in den Rückhaltebehälter ein. Passen Sie die Menge an Seidenpapier so an, dass nur wenig Platz für Bewegung, aber genügend Platz zum Atmen bleibt.
5. Stellen Sie sicher, dass die Maus regelmäßig atmet.
6. Erwärmen Sie den Schwanz mit einer Infrarotlampe für 30-60s. Achten Sie sorgfältig auf Anzeichen von Überhitzung.
7. Reinige den Schwanz mit einem Alkoholtupfer.
8. Führen Sie die Nadel fast waagerecht in eine der beiden seitlichen Schwanzvenen in der Nähe des Schwanzansatzes ein.
   Anmerkung: Bei erfolgreicher Platzierung kann eine kleine Menge Blut in den Nadelkegel zurückfließen. Es wird nicht empfohlen, aktiv zu aspirieren, da jede zusätzliche Bewegung der Nadel zu einer Verschiebung und/oder Verletzung der Vene führen kann.
9. Injizieren Sie das Gesamtvolumen innerhalb von 8-10 s in die Schwanzvene.
10. Entfernen Sie sofort die Maus aus dem Rückhaltesystem. Komprimieren Sie die Injektionswunde für mindestens 30 s oder bis die Blutung nachlässt.
11. Platzieren Sie die Maus in einem separaten Käfig. Sobald sich die Maus von dem Eingriff erholt hat (ca. 30–60 Minuten), bringen Sie die Maus zurück in ihren ursprünglichen Käfig. Überprüfen Sie die Maus regelmäßig für die nächsten 24 h.
    Anmerkung: Eine leichte Sedierung der Maus wird routinemäßig bis zu 2 Stunden nach der Injektion beobachtet.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
NaCl 0,9%	Braun	3200905	Träger für intravenöse Injektionen
Falcon Konische Tube 50ml	Corning Biowissenschaften	352095
Infrarot-Lampe	N/A	N/A	Zum Erwärmen des Mausschwanzes
Plasmide zur Klonierung von Dornröschen-Transposon-Vektoren für HTVI.
pTC	n/a		Vektor für die konstitutive Genexpression
pEN_TTmcs	Addgene	#25755	Eintrittsvektor für induzierbare Genexpression
pEN_TTGmiRc2	Addgene	#25753	Eintrittsvektor für induzierbare miRshRNA-Expression mit Koexpression von GFP
pEN_TTmiRc2	Addgene	#25752	Eintrittsvektor für induzierbare miRshRNA-Expression ohne Koexpression von GFP
pTC ApoE-Tet	Addgene	#85578	Expressionsvektor für induzierbare Gen- oder miR-shRNA-Expression mit ApoE.HCR.hAAT-Promotor
pTC-CMV-Tet	Addgene	#85577	Expressionsvektor für die induzierbare Gen- oder miR-shRNA-Expression mit CMV-Promotor