Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation: Eine Methode zur genetischen Transformation des Reisgenoms mittels gentechnisch verändertem Agrobacterium tumefaciens

Zusammenfassung

Quelle: Xu, D., et al. Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation, transgene Produktion und ihre Anwendung für die Untersuchung der männlichen Fortpflanzungsentwicklung in Reis. J. Vis. Exp. (2020).

In diesem Video demonstrieren wir die genetische Transformation des Reisgenoms mit Hilfe eines binären Vektors von Agrobacterium tumefaciens. Dieses Bakterium erleichtert die Übertragung eines fremden DNA-Plasmids mit Hilfe von Agrobacterium-Virulenzproteinen.

Protokoll

1. Genetische Transformation von Reis und pflanzliche Gewebekultur

1. Kallusinduktion und -regeneration
   Anmerkung: Verwenden Sie frische junge Reisblütenstände als Ausgangsmaterial, um Hornhaut zu induzieren (Abbildung 1).
   1. Sammeln Sie die jungen Blütenstände aus dem Reisfeld oder Gewächshaus im Meiosestadium, bestimmt durch die Blütenlänge von 1,6-4,8 mm (Abbildung 1A). Darauf achten, dass die Reisblütenstände mit Blattscheide bedeckt sind. Wischen Sie jeden Blütenstand mit einem 70%igen Alkoholtupfer ab und lassen Sie ihn trocknen, bevor Sie ihn schneiden.
   2. Bringen Sie den Blütenstand auf eine saubere, sterile Bank. Schneiden Sie es mit einer sterilisierten Schere in kleine Stücke (je kleiner, desto besser) und geben Sie die Stecklinge dann auf eine Petriplatte, die NBD2-Medium enthält (Abbildung 1B, Tabelle 1).
   3. Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei 26 °C für etwa 10-14 Tage, um Kallus zu induzieren (Abbildung 2A).
      Anmerkung: Verwenden Sie den neu gebildeten Kallus für die Infiltration von Agrobacterium (Schritt 1.2.7) direkt oder konditionieren Sie ihn noch einmal in frischem NBD2-Medium, um mehr Kallus zu erhalten. Übertragen Sie die Hornhaut alle 8–10 Tage in das neue NBD2-Medium.
2. Transformation und Co-Kultivierung
   1. Für die Transformation werden A. tumefaciens-Bakterien verwendet, die das binäre Plasmid mit dem sgRNA-CAS9-Konstrukt enthalten. Lagern Sie die A. tumefaciens-Stämme in YEB-Medium (Tabelle 1) mit 50 % Glycerin bei -80 °C zur weiteren Verwendung.
   2. Streifen Sie A. tumefaciens von einem -80 °C Glycerinstamm zu YEB-Agar-Medium, das selektive Antibiotika enthält (Tabelle 1) und wachsen Sie 48–72 h lang bei 25–28 °C, damit Kolonien entstehen können.
   3. Eine einzelne Kolonie aus der YEB-Platte mit selektiven Antibiotika auf 5 ml flüssiges YEB-Medium, das die gleichen selektiven Antibiotika enthält (Tabelle 1), wird in einem konischen sterilen Reagenzglas von 50 ml geimpft. Auf einem Orbitalschüttler bei 250 x g bei 25–28 °C schütteln, bis die Bakterien auf einen OD₆₀₀ von 0,5 anwachsen.
   4. 1 ml Bakteriensuspension zu 100 ml YEB-Medium (Tabelle 1) mit den gleichen selektiven Antibiotika in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben geben und auf einem Orbitalschüttler bei 250 x g bei 28 °C für 4 h schütteln.
   5. Zentrifugieren Sie bei 4.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur, um Bakterien zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand.
   6. Das Bakterienpellet wird mit AAM-AS-Medium resuspendiert (Tabelle 1) und die Suspension auf einen OD₆₀₀ = 0,4 verdünnt.
      Anmerkung: Der perfekte OD der Bakteriensuspension ist entscheidend für eine effiziente Transformation. Es hilft bei der Beseitigung von übermäßigem Bakterienwachstum auf dem Kallus.
   7. Sammeln Sie etwa 150 gesund wachsende hellgelbe, fragile embryogene Calli aus Schritt 1.1.3 in einen sterilen 150-ml-Kolben. Geben Sie 50–75 mL Bakterienzellsuspension aus Schritt 1.2.6 in den sterilen Kolben und fügen Sie dann etwas 10–25 mL frisches AAM-AS-Medium hinzu, um die Calli 10–20 Minuten lang unter gelegentlichem Schütteln einzutauchen.
   8. Gießen Sie die Bakteriensuspension vorsichtig aus dem Kolben aus und trocknen Sie die überschüssige Bakteriensuspension mit sterilem Filterpapier #1 oder Seidenpapier aus der Hornhaut ab. Legen Sie sie dann auf eine Petrischale mit NBD-AS-Medium (Tabelle 1), das mit einem sterilen Filterpapier #1 bedeckt ist. 3 Tage lang bei 25–28 °C im Dunkeln inkubieren und auf Bakterienüberwucherung prüfen.
3. Selektion für resistente Hornhaut
   1. Nach 3 Tagen Co-Kultivierung werden die Calli in eine sterile Petrischale mit einem sterilen Filterpapier umgefüllt.
   2. Trocknen Sie die Calli 2 Stunden lang an der Luft auf einer sauberen Bank. Achten Sie darauf, dass die Hornhaut nicht am Filterpapier haftet.
   3. Übertragen Sie die Calli gleichmäßig mit einer sterilen Pinzette auf das primäre Selektionsmedium NBD2 (mit 40 mg/L Hygromycin und 250 mg/L Timentin) (Tabelle 1). Celli 2 Wochen lang bei 25–28 °C im Dunkeln kultivieren.
   4. Nach 2 Wochen werden die Calli gleichmäßig auf eine neue Platte mit frischem Selektionsmedium NBD2 (mit 40 mg/l Hygromycin und 250 mg/l Timentin) übertragen (Tabelle 1). Kultivieren Sie die Calli weitere 2 Wochen bei 25–28 °C im Dunkeln.
4. Kallus-Differenzierung
   1. Übertragen Sie den Kallus auf frisches MS-Medium (mit 25 mg/l Hygromycin und 150 mg/l Timentin) (Tabelle 1). Unter Licht bei 25–28 °C ca. 2 Wochen kultivieren.
   2. Wiederholen Sie Schritt 1.4.1 noch einmal.
   3. Übertragen Sie die Triebknospen in das neue MS-Medium (mit 10 mg/l Hygromycin), um mehr Triebe zu vermehren.

Tabelle 1: Medienkompositionen für die Reisverarbeitung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Ausgangsmaterialien zur Induktion von Kallus. (A) Junge Reisblütenstände im Meiosestadium. (B) Präparierte junge Blütenstände, die auf dem NBD2-Medium wachsen. Stange = 2 cm in (A).

Abbildung 2: Verfahren zur Herstellung transgener L...