1. Elektroporation bei Überexpression von Hh-Rezeptor-Transgenen: pEGFP-Smo
- Für die Elektroporation mit einer Küvette mit einem Abstand von 2 mm ist für jede Elektroporationsreaktion das folgende Plasmid-Zell-Elektroporationsgemisch herzustellen: 1,2 × 106 primäre Kleinhirn-Körnerzell-Vorläuferzellen der Maus und 10 μg pEGFP-mSmo (die DNA-Stammkonzentration auf ~2-5 μg/μl in Tris-EDTA-Puffer oder steril dH2O einstellen) in 100 μl Opti-MEM.
Anmerkung: Reduzieren Sie die Gesamtzahl der Zellen, wenn die Zellen unzureichend sind (obwohl dies die Effizienz der Elektroporation verringern kann). Passen Sie jedoch weder die Menge des Plasmids noch das Gesamtvolumen von Opti-MEM an, das pro Küvette verwendet wird. Wenn die für das Experiment erforderliche Gesamtzellzahl 1,5 × 106 Zellen übersteigt, skalieren Sie das Elektroporationsgemisch entsprechend und führen Sie mehrere Elektroporationsreaktionen separat durch. Die Küvette kann bis zu 5 Mal wiederverwendet werden.
- Bereiten Sie die Aussaatplatte für die Zellen nach der Elektroporation vor, indem Sie 0,5 ml Kulturmedium in jede Vertiefung der 24-Well-Kulturplatte mit beschichteten Deckgläsern geben und in einem CO2 -Inkubator bei 37 °C warm halten. Um die Deckgläser für die Zellanheftung vorzubereiten, inkubieren Sie autoklavierte 12-mm-Glasdeckgläser mit 100 μg/ml Poly-D-Lysin (PDL, 1 mg/mL in sterilem dH2O) für mindestens 1 h bei 37 °C. Bewahren Sie die Deckgläser bis zur Verwendung in derselben PDL-Lösung bei 4 °C auf.
- Pipettieren Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und schleudern Sie es bei 200 × g für 5 Minuten bei RT. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 μl Opti-MEM. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal mit Opti-MEM, um sicherzustellen, dass sich kein Restkulturmedium im Röhrchen befindet.
Anmerkung: Für jede Vertiefung/Deckglas einer 24-Well-Platte 1,2-1,3 × 106 Zellen/Vertiefung elektroporatisieren und aussäen, um am nächsten Kulturtag eine Zellkonfluenz von ~70-75 % zu erhalten.
- Stellen Sie die Parameter der Elektroporation wie in Tabelle 1 gezeigt ein.
- Pipettieren Sie die Elektroporationsreaktion vorsichtig, um sie gut zu mischen, und übertragen Sie mit einer langen P200-Spitze ein genaues Volumen von 100 μl der Mischung in die Küvette mit einem Abstand von 2 mm. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
- Legen Sie die Küvette in die Küvettenkammer.
- Drücken Sie die Ω Taste des Elektroporators (siehe Materialtabelle) und notieren Sie sich den Impedanzwert, der ~30-35 betragen sollte. Um sicherzustellen, dass der elektrische Impedanzwert Ω im Bereich von 30-35 liegt, halten Sie sich an ein präzises Volumen von 100 μL.
- Drücken Sie die Starttaste, um den Impuls einzuleiten.
- Notieren Sie die Werte des gemessenen Stroms und der Joule, die auf dem Leserahmen angezeigt werden.
- Nehmen Sie die Küvette aus der Küvettenkammer.
- Geben Sie sofort 100 μl vorgewärmtes Nährmedium in die Küvette und resuspendieren Sie es durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren 2-3 Mal. Die Zellsuspension wird sofort auf die 24-Well-Platte mit den beschichteten Deckgläsern überführt, die in Schritt 1.2.
hergestellt wurden
Anmerkung: Um den Zelltod zu minimieren, säen Sie die Zellen unmittelbar nach der Elektroporation aus.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator. Lassen Sie die Zellen 3 h lang ungestört, um eine Zellablösung zu vermeiden.
- 3 Stunden nach der Aussaat die Hälfte des überstehenden Mediums vorsichtig aspirieren und verwerfen, um schwimmende abgestorbene Zellen und Ablagerungen zu entfernen, und durch die gleiche Menge vorgewärmten Kulturmediums ersetzen.
- Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C im CO2 -Inkubator.
| Poring Puls Einstellung | Einstellung des Transferimpulses |
| Primäre GCPs mit Maus | Primäre Neuronen | Primäre GCPs mit Maus | Primäre Neuronen |
| Spannung | 275 V | 275 V | 20 V | 20 V |
| Länge | 1 ms | 0,5 ms | 50 ms | 50 ms |
| Intervall | 50 ms | 50 ms | 50 ms | 50 ms |
| Nein. | arabische Ziffer | arabische Ziffer | 5 | 5 |
| D-Tarif | 10 % | 10 % | 40% | 40% |
| Polarität | + | + | ± | ± |
Tabelle 1: Die Elektroporationsparameter von primären GCPs und primären Neuronen der Maus mit dem Super Electroporator NEPA21 TYPE
