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1. Nukleofektion von Merozoiten oder Sporozoiten
- Vorbereitung vor der Nukleofektion von Parasiten
- Bereiten Sie ca. 107 Merozoiten oder Sporozoiten in einer Tube vor. Bei der Transfizierung von Merozoiten bereiten Sie 3-4 Röhrchen vor.
- Bereiten Sie eine Menge Plasmid-DNA oder gereinigtes PCR-Fragment vor, die größer oder gleich 10 μg ist.
Anmerkung: Das in dieser Studie verwendete Plasmid enthält 2 Gene: das verstärkte gelbe fluoreszierende Protein (EYFP) und die Dihydrofolat-Reduktase-Thymidylat-Synthase, die von Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS) abgeleitet ist.
- Bereiten Sie 25 U Restriktionsenzym vor. Werden Plasmide linearisiert, kann das Restriktionsenzym die Transfektionseffizienz verbessern. Wenn die Plasmide zirkulär sind, lassen Sie das Restriktionsenzym weg.
- Bereiten Sie 85 μl Nukleosektionspuffer vor (Tabelle 1): Mischen Sie 20 μl Nukleofektionpuffer I und 1 ml Nukleofektionpuffer II und verwenden Sie einen Teil der Lösung. Das Volumen des Gesamtpuffers beträgt 100 μL.
- Nukleofektion
- Die Sporozoit- oder Merozoitensuspension bei 600 x g für 10 min zentrifugieren. Entsorgen Sie dann den Überstand.
- In der folgenden Reihenfolge werden 85 μl nukleärer Transfektionspuffer, 10 μg Plasmid (PCR-Fragment) und 25 μl Restriktionsenzym (normalerweise 5 μl) in das 1,5-ml-Röhrchen mit Sporozoiten oder Merozoiten gegeben.
- Die Suspension in einen nuklearen Transfektionsbecher überführen. Setze den Becher in eine nukleare Transferrille ein.
- Schalten Sie das Nukleofektionsgerät mit dem Netzschalter ein und wählen Sie das Transfektionsverfahren U-033 aus. Wenn das Nukleofektionsgerät im Modus "Freie Programmwahl" startet, verlassen Sie diesen Modus, indem Sie die X-Taste drücken.
- Wenn das Programm beendet ist, drücken Sie die X-Taste des Nukleofektionsgeräts, und der Bildschirm sollte OK anzeigen, was anzeigt, dass die Nukleofektion erfolgreich war.
- Geben Sie 0,5-1 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) in den Nukleofektionbecher, um die Reaktion zu stoppen, und überführen Sie die Suspension nach vorsichtigem Mischen in ein 1,5-ml-Röhrchen.
| Puffer
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Zusammensetzung
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| Nukleofektionspuffer I | ATP-Dinatrium 2g, MgCl 2-6H2O 1,2g, 10 ml Wasser |
| Nukleofektionspuffer II | KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, Glukose 0,2 g, 500 ml Wasser |
| *Wasser: destilliertes Wasser | |
Tabelle 1: Zusammensetzung der Puffer.