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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Entferne Kumuluszellen aus befruchteten Eizellen.
- Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop 2 Insulinspritzen: die erste, um den Eileiter zu halten, und die zweite, um die Ampulle aufzureißen und befruchtete Eizellen in die Hyaluronidase-Arbeitslösung zu verteilen.
- Nehmen Sie die vorbereitete Glaspipette zum Sammeln von Eiern und schließen Sie sie an den Schlauch und einen am Mundstück montierten 0,22-μm-Filter an, um alle Eier abzusaugen. Sammeln Sie alle Eier und waschen Sie sie durch nacheinander in 6 verschiedene Tropfen à 100 μl M2-Medium.
- Die gewaschenen befruchteten Eier werden in einen befeuchteten 37 °C-Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO2 in M16-Medium gegeben.
>2. Herstellung von Injektionspipetten
- Verwenden Sie dünnwandige Glaskapillarschläuche (10-15 cm lang) mit einem Außendurchmesser von 1 mm und klemmen Sie diese Kapillare in einen horizontalen Mikropipettenabzieher.
Anmerkung: Bei den meisten horizontalen Pipettenabziehern können 3 Parameter eingestellt werden: Wärmeleistung, Zugkraft und Zeitverzögerung zwischen Erhitzen und Ziehen. Passen Sie diese Parameter an, um injizierbare Pipetten zu erhalten, die denen in Abbildung 1A dargestellten ähneln. Für Benutzer, die routinemäßig DNA-Mikroinjektionen durchführen, verwenden Sie die Standardeinstellungen und passen Sie die Verzögerung zwischen Erhitzen und Ziehen an, um die globale Form der Pipettenspitze zu ändern.
>3. Herstellung von Haltepipetten
- Verwenden Sie eine Injektionspipette, um die Haltepipette vorzubereiten.
- Befestigen Sie eine Injektionspipette an einer Mikroschmiede. Schneiden Sie die Pipette mit der Microforge ab, um eine scharfe symmetrische Spitze von 80 bis 100 μm Durchmesser zu erhalten. Anschließend polieren Sie die Spitze mit Hitze auf der Mikroschmiede, um eine symmetrische runde Form ohne scharfe Hecken zu erhalten.
>4. Vorbereitung einer Injektionspipette mit dem lentiviralen Vektor
- Zentrifugieren Sie die Suspension des lentiviralen Vektors bei 160 x g für 2 Minuten, um Rückstände zu pelletieren, die häufig in gefrorenen lentiviralen Stämmen vorhanden sind.
- Den Überstand zurückgewinnen und in ein neues 0,5-ml-Röhrchen in einer Sicherheitswerkbank der Klasse II umfüllen.
- 1 μl Überstand wird mit einem Mikrolader in eine Injektionspipette überführt, die wie in Schritt 5 beschrieben hergestellt wurde.
- Setzen Sie die Injektionspipette auf den Instrumentenhalter des rechten Mikromanipulators. Verbinden Sie die Haltepipette mit dem linken Mikromanipulator.
Anmerkung: Der Transduktionstiter des lentiviralen Vektors korreliert direkt mit der Wirksamkeit der Gründerproduktion. Für eine hohe Wirksamkeit (>70%) verwenden Sie virale Vektoren mit einem Titer im Bereich von 100 ng p24-Kapsidprotein/μl. Wenn der Titer in Transduktionseinheiten (TU) ausgedrückt wird, sollte der Titer über 109 TU/ml liegen. Lentivirale Vektorstämme müssen durch transiente Transfektion von 293T-Zellen mit dem p8.91-Verkapselungsplasmid pHCMV-G hergestellt werden, das für das Glykoprotein des vesikulären Stomatitisvirus (VSV) kodiert, wie in ergänzenden Methoden beschrieben.
>5. Mikro-Injektion
- Geben Sie 8 μl M2-Medium in die Mitte eines Objektträgers und bedecken Sie es mit leichtem Paraffinöl (embryogetestet), um eine Verdunstung zu vermeiden.
- Legen Sie 20 Eier so wenig wie möglich in den Tropfen.
Vorsicht: Machen Sie keine Blasen beim Ablegen der Embryonen.
- Vergewissern Sie sich, dass die Spitze der Injektionspipette offen ist. Wenn nicht, klopfen Sie mit der Haltepipette auf die Injektionspipette.
- Stellen Sie den Mikroinjektor auf eine Injektionszeit von 20 s.
Anmerkung: Die Viskosität der Virussuspension ermöglicht eine klare Visualisierung der Dispersion des viralen Vektors im perivitellinischen Raum. Der Injektionsdruck sollte so eingestellt werden, dass er innerhalb von 20 s nach der Injektion den gesamten Raum ausfüllt, was einem Volumen von 10 bis 100 pL entspricht. Der Einspritzdruck sollte 600 hPa nicht überschreiten.
- Aspirieren Sie eine befruchtete Eizelle, die 2 Vorkerne und 2 Polkörper enthält, mit der Haltepipette unter dem Stereomikroskop
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- Injizieren Sie das Ei mit dem Mikroinjektor in den perivitellinischen Raum.
Vorsicht: Berühren Sie die Plasmamembran nicht mit der Injektionspipette.
- Injizieren Sie alle befruchteten Eier, die in Chargen von 20 Eiern erhältlich sind, und legen Sie die injizierten Eier sofort in vorgewärmtes M16-Medium in den befeuchteten 37 °C-Inkubator mit einer Atmosphäre von 5 % CO2,
Anmerkung: Inkubieren Sie die injizierten Eizellen mindestens 30 Minuten nach der Injektion, bevor Sie den Embryo übertragen.
