Lasergestützte lentivirale Genabgabe: Eine Technik zur Permeabilisierung von befruchteten Eiern von Mäusen, um die lentivirale Genübertragung zu erleichtern

Zusammenfassung

Quelle: Martin, N. P., et al. Lasergestützte lentivirale Genabgabe an befruchtete Mauseier. J. Vis. Exp. (2018).

In diesem Video demonstrieren wir die lasergestützte Permeation der Schutzschicht der Zona pellucida in Mäuseeiern, um die lentivirale Genübertragung zu erleichtern. Das Lentivirus ermöglicht die Erzeugung transgener Tiere mit einem Gen von Interesse, das stabil in ihr Genom integriert ist.

Protokoll

1. Perforation von Mäuseeiern mit XYClone-Laser

1. XYClone Laser nach Herstellerempfehlung einrichten und kalibrieren. Andere Laser, die typischerweise für die In-vitro-Fertilisation verwendet werden, können den XYClone-Laser ersetzen, um befruchtete Eizellen zu perforieren.
   1. Befestigen Sie das Kabel der Laser-Controller-Box an der Laserapparatur am Mikroskop.
   2. Schließen Sie die Laser-Controller-Box über einen USB-Anschluss an den Computer an, auf dem die Lasersoftware ausgeführt wird. 3.1.3. Stecken Sie den Lasercontroller ein und schalten Sie ihn ein.
   3. Perforieren Sie mit Blick durch das Okular ein Prüfmuster (z. B. trocken abwischbare Markierungen auf einem Objektträger).
   4. Verwenden Sie einen kleinen Schraubendreher (im Laser-Kit enthalten), um die X- und Y-Position des Lasers an das durch das Mikroskopokular sichtbare LED-Licht anzupassen und den Laser zu kalibrieren.
2. Legen Sie eine KSOM-Fallplatte mit von Mäusen befruchteten Eiern auf den Mikroskoptisch. Bewahren Sie die Platte nicht länger als 15 Minuten außerhalb des Inkubators auf.
3. Schauen Sie durch das Mikroskop-Okular und stellen Sie sicher, dass die Zona pellucida des Embryos scharf ist und das Laser-LED-Licht sichtbar ist.
4. Bewegen Sie den Mikroskoptisch so, dass er mit dem LED-Licht/Laser auf die Zone zielt.
5. Mit der Computersoftware wird der XYClone-Laser auf 250 μs eingestellt.
6. Stellen Sie die LED-Lichtgröße auf die gewünschten Abmessungen ein (Einstellung 5 in diesem Experiment).
7. Perforieren Sie die Zona jedes befruchteten Eies dreimal mit dem Laser. Die Zona kann entweder durchstochen oder ausgedünnt werden. Mit den oben genannten Einstellungen erzeugt der Laser ein Loch mit einem Durchmesser von 10 μm (Abbildung 1).
   Anmerkung: Das Zielen in der Nähe des Polkörpers hält den Laser von der embryonalen Zelle fern.
8. Lassen Sie befruchtete Eizellen 2 Stunden lang im Gewebekultur-Inkubator erholen, bevor Sie zum nächsten Schritt übergehen.

2. Transduktion von Mäuseeiern nach XYClone-Laserperforation

1. Pipettieren Sie 2 μl konzentriertes Lentivirus (größer als 1e8 TU/ml-Titer) in den 50 μl KSOM-Tropfen. Pipettieren Sie nicht auf und ab. Befruchtete Eier heften sich leicht an die Pipettenspitze. Basierend auf unseren Erfahrungen ist die 1e5-5e5-transduzierende Einheit des Lentivirus in einem Volumen von weniger als 3 μl optimal für die Genübertragung.
2. Lassen Sie befruchtete Eizellen 4 Tage lang im Inkubator zu Blastozysten entwickeln. Das Medium muss nicht gewechselt werden.

3. Nicht-chirurgischer Transfer von transduzierten Mausembryonen auf pseudoschwangere Mäuse

1. Verwenden Sie pseudoschwangere Mäuse 3,5 Tage nach der Paarung.
2. Verwenden Sie ein nicht-chirurgisches Embryotransfergerät (NSET), um Mausembryonen in pseudoschwangere Mäuse zu implantieren.
   1. Führen Sie mit einem Operations- oder Präpariermikroskop ein Vaginalspekulum ein, um den Gebärmutterhals sichtbar zu machen.
   2. Führen Sie das Gerät für den nicht-chirurgischen Embryotransfer (NSET) etwa 5 mm in den Gebärmutterhals ein und legen Sie die Embryonen in einem Volumen von ca. 2 μl ab. < br /> Anmerkung: Für jeden Transfer wird ein steriles NSET-Gerät verwendet und nach dem Eingriff entsorgt. Alle Reagenzien, die bei der Manipulation der Embryonen verwendet werden, müssen steril sein.
3. Übertragen Sie 10–15 gesunde Blastozysten in 2 μl Volumen KSOM auf jede pseudoschwangere Maus.
4. Überwachen und messen Sie die Gewichtszunahme bei pseudoschwangeren Mäusen in den folgenden Tagen weiterhin, um festzustellen, ob die NSET erfolgreich war.
5. Erholen Sie die Jungen, indem Sie den trächtigen Mäusen erlauben, auf natürlichem Wege zu gebären, oder indem Sie 17 Tage nach dem Embryotransfer einen Kaiserschnitt durchführen. Ein Kaiserschnitt ist oft notwendig, wenn nur sehr wenige Embryonen vorhanden sind und diese zu groß für eine natürliche Geburt werden.
6. Sammeln Sie Gewebe von Jungtieren für die Genotypisierung, um die Transgeneserate zu bestimmen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Laserbehandlung von Mäuseeiern, die befruchtet wurden. Beispiele für das Perforieren der Zona, um ein Loch zu erzeugen, vs. das Ausdünnen der Zona.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CD510B-1-Plasmid	Systemische Biowissenschaften	Nr. CD510B-1	wird verwendet, um das Lentivirus, das EF1a-copGFP exprimiert, zu verpacken
Dimethylpolysiloxan	Sigma	DMPS5X	Kultivierung von Embryonen
XYClone-Laser	Hamilton Thorne Biowissenschaften		Perforieren von von Mäusen befruchteten Eiern
Gerät für den nicht-chirurgischen Embryotransfer (NSET)	ParaTechs	60010	NSET von Embryonen
KSOM mittel	Millipore	MR-020P-5F	Kultivierung von Embryonen
Zusammensetzung von KSOM:			mg/100 ml
NaCl			Nr. 555
Kcl			18,5
KH2PO4			4,75
MgSO4 7H2O			4,95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			Nr. 210
Traubenzucker			3,6
Na-Pyruvat			2.2
DL-Milchsäure, Natriumsalz			0,174 ml
10 mM EDTA			100μL
Streptomycin			5
Penizillin			6,3
0,5 % Phenolrot			0,1 ml
L-Glutamin			14,6
MEM Essentielle Aminosäuren			1 ml
MEM Non-essential AA			0,5 ml
Bsa			100

kg kg kg kg kg kg kg