Biolistisch-vermittelter Gentransfer: Eine Technik zur Verabreichung von Genen von Interesse in Zielzellen über eine biolistische Genkanone

Zusammenfassung

Quelle: Taylor, T., et al. Biolistische Transformation eines fluoreszierenden markierten Gens in den opportunistischen Pilzerreger Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (2015).

In diesem Video demonstrieren wir das Protokoll der biolistischen Gen-Gun-vermittelten Genabgabe in kultivierten Zellen. Diese Methode bietet eine einfache Methode der stabilen genetischen Transformation mit einer minimalen Menge an DNA.

Protokoll

>1. DNA-Vorbereitung

1. Bereiten Sie orangefarbene biolistische Makroträgerscheiben vor, indem Sie sie mit einer Pinzette in 100%iges Ethanol tauchen. Legen Sie die Scheiben zum Trocknen in eine große Petrischale mit Trockenit (achten Sie darauf, dass der Trockenit die Scheiben nicht berührt).
2. Nach dem Trocknen die Macrocarrier-Scheiben in die silbernen Scheibenhalter drücken (zuvor mit 100% Ethanol abgewischt).
3. Vortex-Gold-Microcarrier-Kügelchen werden in 100 % Ethanol suspendiert und 12 μl in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert, ein Röhrchen pro Transformation.
4. Zu jedem Röhrchen der Reihe nach hinzufügen: 2 μg DNA (vorzugsweise 2 μl von 1 μg/μl DNA), 10 μl 2,5 M CaCl₂ und 2 μl 1 M spermidinfreie Base.
5. Richten Sie eine Negativkontrolle wie in Schritt 1.4 ein, jedoch ohne DNA.
6. Jedes Röhrchen verwirbeln und 5 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubieren. Gelegentlich vorsichtig mit jedem Röhrchen schnippen, um die abgesetzten Kügelchen während dieser Inkubation wieder zu suspendieren.
7. Schleudern Sie die Röhrchen bei 225 x g für 30 Sekunden, um die DNA-beschichteten Goldkügelchen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig (durch Pipettieren oder Aspiration) und entsorgen Sie ihn.
8. Resuspendieren Sie die Kügelchen vollständig in 600 μl 100 % Ethanol, indem Sie sie langsam auf und ab pipettieren.
9. Schleudern Sie die Röhrchen bei 225 x g für 30 Sekunden, um die Kügelchen ohne Packung zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und entsorgen
Sie ihn.
10. Resuspendieren Sie die DNA-beschichteten Goldkügelchen in 8 μl 100 % Ethanol, indem Sie langsam auf und ab pipettieren.
11. Pipettieren Sie die DNA-beschichteten Goldkügelchen in einem Durchmesser von 1 cm auf die Mitte der biolistischen Scheibe und lassen Sie sie trocknen.
    Anmerkung: Ein getrockneter Goldkreis, der in der Mitte der biolistischen Scheibe sichtbar ist, deutet darauf hin, dass eine ausreichende Konzentration an Goldperlen vorhanden ist.
    Anmerkung: Die mit DNA-beschichteten Goldkügelchen bestückten Makrocarrier-Scheiben sind nun bereit für den Einsatz mit der Genkanone.

>2. Bedienung der Genkanone

1. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein.
2. Schalten Sie das Heliumgas ein, indem Sie den Knopf gegen den Uhrzeigersinn drehen, bis ein Druck von ca. 2.200 psi auf dem Manometer erreicht ist.
3. Schalte die Genkanone ein, indem du den roten Schalter links umlegst.
4. Stellen Sie sicher, dass die Durchflussraten für das Vakuum und die Entlüftung so eingestellt sind, dass das Vakuum innerhalb von 15 Sekunden 28 Zoll Hg erreicht.
5. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Berstscheibe und dem Makroträger ca. 3/8 Zoll beträgt.
6. Reinigen Sie die gesamte Kammer, indem Sie sie mit Ethanol abwischen.
7. Tauchen Sie die Berstscheiben in 100 % Ethanol. Auf einer sterilen Oberfläche (z.B. Petrischale) trocknen lassen.
8. Verwenden Sie einen Drehmomentschlüssel, um den Berstscheibenhalter zu lösen. Setzen Sie eine saubere Berstscheibe in den Halter ein. Schrauben Sie den Berstscheibenhalter wieder fest und ziehen Sie ihn mit einem Drehmomentschlüssel fest, indem Sie ihn einmal nach rechts drehen.
   Anmerkung: Die Berstscheiben werden nach jedem Schuss ausgetauscht.
9. Tauchen Sie die Siebe in 100 % Ethanol. Auf einer sterilen Oberfläche (z.B. Petrischale) trocknen lassen.
10. Legen Sie nach dem Trocknen ein gewaschenes Gitter auf die weiße Kunststoff-Montageplatte. Setzen Sie den Macrocarrier-Disc-Halter mit der DNA-Seite nach unten in die Disc-Kammer ein. Schrauben Sie die silberne Kappe auf und setzen Sie die Montageplatte in den höchsten Schlitz.
    Anmerkung: Das Gitter wird nach jedem Schuss ausgetauscht.
11. Legen Sie eine YPD-Agarplatte mit 1 M Sorbit auf die Bodenplatte.
12. Kammertür schließen und verriegeln.
13. Halten Sie den mittleren roten Schalter gedrückt, um das Vakuum zu aktivieren, und lassen Sie das Vakuum 28 Zoll Hg erreichen. Sobald das richtige Vakuumniveau erreicht ist, stellen Sie diesen Schalter in die untere Position. Wenn du bereit bist, halte den roten Schalter auf der rechten Seite gedrückt, um zu schießen. Wenn die Berstscheibe platzt, lassen Sie sofort den Feuerknopf los und drücken Sie den mittleren roten Schalter in die mittlere Position, um die Kammer auf 0 psi zu entlüften.
14. Reinigen Sie die Ablagerungen der Berstscheibe und schalten Sie die Genkanone aus. Schalten Sie dann das Heliumgas aus, indem Sie den Knopf im Uhrzeigersinn drehen, und schalten Sie schließlich die Vakuumpumpe aus.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,6 μm Goldperlen	Bio-Rad	Tel.: 165-2262	http://www.bio-rad.com
Spermadinfreie Basis	Sigma- Aldrich	Nr. S0266	https://www.sigmaaldrich.com
1350 psi Berstscheiben	Bio-Rad	Tel.: 165-2330	http://www.bio-rad.com
Stoppen von Bildschirmen	Bio-Rad	Tel.: 165-2336	http://www.bio-rad.com
Macrocarrier-Scheiben	Bio-Rad	Tel.: 165-2335	http://www.bio-rad.com
PDS-1000/He System	Bio-Rad	Tel.: 165-2257	http://www.bio-rad.com
Mikrofuge 18 Zentrifuge	Beckman Coulter	F241.5P	www.beckmancoulter.com