Magnetofektion-basierte Transfektion in vitro: Eine magnetfeldgestützte Technik zur Verabreichung von Plasmiden in primäre neuronale Zellen der Maus mit magnetischen Nanopartikeln

Zusammenfassung

Quelle: Jacquier, A. et al. Modellierung der Charcot-Marie-Tooth-Krankheit in vitro durch Transfektion primärer Maus-Motoneuronen. J. Vis. Exp. (2019)

In diesem Video demonstrieren wir die magnetisch gesteuerte Transfektion von Plasmid-DNA in primären neuronalen Zellkulturen. Die Magnetofektion verwendet ein externes Magnetfeld, um die Abgabe von Plasmiden, die an magnetische Nanopartikel gebunden sind, in das Zytoplasma der Zelle zu steuern.

Protokoll

>1. Poly-Ornithin/Laminin (Po/L) Schalenbeschichtung

HINWEIS: Die Volumina sind angepasst, um eine 24-Well-Platte zu beschichten.

1. Legen Sie bei Bedarf ein steriles 12 mm Deckglas in die Vertiefung.
2. Die Vertiefungen werden mit 500 μl 10 μg/ml Poly-L-Ornithin-Lösung, gelöst in Wasser, bestreicht.
3. Lassen Sie die Vertiefungen 1 h bei Raumtemperatur absetzen.
4. Die Poly-L-Ornithin-Lösung entfernen und 30 min an der Luft trocknen lassen.
5. Die Vertiefungen über Nacht bei 37 °C mit 500 μl 3 μg/ml Laminin in Bicarbonat L-15,
   beschichten Anmerkung: Vertiefungen können bei 37 °C für 7 Tage im Inkubator gelagert werden. Bei langen Inkubationen kann die Zugabe von sterilem PBS zwischen den Vertiefungen helfen, eine mittlere Verdunstung zu vermeiden.

>2. Motoneuronen-Kultur

1. Verdünnen Sie die MNs auf die entsprechende Dichte, in der Regel 5.000 bis 10.000 Zellen in 500 μl Kulturmedium pro Well in einer 24-Well-Platte.
   Anmerkung: Die Seeding-Dichte liegt bei etwa 30.000 bzw. 1.500 Zellen für 6- bzw. 96-Well-Platten.
2. Entfernen Sie die Lamininlösung mit einem P1000.
3. Übertragen Sie die im Nährmedium verdünnten MNs sofort in die Beschichtungsplatten, um ein Austrocknen zu vermeiden.
4. Inkubieren Sie die Kultur 2 Tage lang bei 37 °C.

>3. Magnetofektion von Motoneuronen

HINWEIS: In den folgenden Schritten sind die verwendeten Mengen für die Transfektion einer Vertiefung einer 24-Well-Platte bestimmt. Bitte beachten Sie das Protokoll des Herstellers für ein anderes Format.

1. Für die DNA-Präparation 1 μg DNA in 50 μl neuronalem Kulturmedium resuspendieren und 5 s lang vortexen. Hier werden 9 kb Plasmide mit einem CAGGS-Promotor (pCAGEN) verwendet, der die Neurofilament-cDNA kontrolliert.
2. Für die Vorbereitung des Bead-Röhrchens resuspendieren Sie 1,5 μl der Beads in 50 μl neuronalem Kulturmedium.
3. Die 50 μl Bead-Lösung zur 50 μl DNA-Lösung geben und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren (Gesamtvolumen = 100 μl).
4. Während dieser Inkubation werden 100 μl Kulturmedium aus der Vertiefung entnommen, die transfiziert werden soll.
   HINWEIS: Legen Sie die Magnetplatte in den Inkubator, um sie auf 37 °C zu erwärmen.
5. Übertragen Sie 100 μl des DNA/Bead-Mixes in die Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 20–30 Minuten auf der Magnetplatte bei 37 °C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Plasmid pCAGEN	Addgene	#11160
Nährmedium für Neuronenzellen	ThermoFisher Scientific	A3582901	Neurobasal Plus Medium
Poly-DL-Ornithin	Sigma-Aldrich	Nr. P8638
Laminin	Sigma-Aldrich	Nr. L2020
Natriumbicarbonat	ThermoFisher Scientific	25080094
L-15 mittel	ThermoFisher Scientific	11415056
PBS ohne Ca Mg	ThermoFisher Scientific	14190144	Ohne Mg2+ Ca2+
Rundes Deckglas	NeuVitro, Knittel Glas	GG-12-PRE	ca. 12 mm