>1. Retrovirales Konstrukt vorbereiten
- Subklonieren Sie die alpha- und beta-Ketten des T-Zell-Rezeptors (TCR), getrennt durch einen 2A-Linker, in einen MSCV-basierten retroviralen Vektor (z. B. pMIAII oder pMIGII).
Anmerkung: Der 2A-Linker ermöglicht die stöchiometrische und konkordante Expression der alpha- und beta-TCR-Ketten aus einem einzigen offenen Leserahmen. Der Vektor umfasst eine IRES-Fluoreszenzproteinkassette (Ametrin oder GFP), die zur Verfolgung transduzierter Zellen und der Transduktionseffizienz verwendet wird.
- Isolieren Sie Plasmid-DNA mit einem kommerziell erhältlichen Plasmavorbereitungskit oder einem ähnlichen Produkt. Verwenden Sie eine Arbeitskonzentration von 1-2 μg μl-1.
>2. Erzeugung retroviraler Produzentenzelllinien
- Verwenden Sie einen zweistufigen Prozess, um die retroviralen Produzentenzelllinien herzustellen.
- Erzeugung eines Retrovirus durch transiente Transfektion von 293T-Zellen mit drei Plasmiden (pVSVG, pEQ-Pam3(-E) und Vector of Interest) und Entnahme des retroviralen Überstands aus den 293T-Zellen zur Transduktion der GP+E86 ökotropen retroviralen Produzentenzelllinie.
- Isolieren Sie die oberen 40 % der fluoreszierenden GP+E86-Produzentenzellen durch FACS und vermehren Sie die transduzierten GP+E86-Produzentzellen als Quelle des Virus.
Anmerkung: Die Erzeugung von Produzenten mit hohen Titern ist entscheidend für die effiziente Transduktion von Knochenmarkzellen.
>3. Retrovirus-vermittelter Stammzell-Gentransfer (Tag -5)
- 0,5 -1,0 x 10 x 106 jeder GP+E86-Produzentenzelllinie in vollständigem DMEM 10 % (vol/vol) FBS auftauen und kultivieren, um ein ausreichendes Wachstum für zwei konfluente 150-mm-Platten bis zum Tag 0 dieses Protokolls zu ermöglichen.
Anmerkung: Das Auftauen von 0,5 - 1,0 x 106 jeder GP+E86-Produzentenzelllinie in einer 10-cm-Platte ermöglicht eine Konfluenz von 30 - 50 % an Tag 5. Dies ermöglicht auch eine 5-tägige Kultur, um die GP+E86-Produzentenzelllinien bis zum Tag 0 auf zwei konfluente 150-mm-Platten zu erweitern.
- Kultur der retroviralen Produzentenzelllinie in kompletten Gewebekulturmedien mit 5 % fötalem Kälberserum und Ciprofloxacin (10 μg/ml), um eine Kontamination mit Mykoplasmen zu vermeiden.
Anmerkung: Die Anwendung von Ciprofloxacin bei der Erzeugung des viralen Überstands für die Knochenmarktransduktion ist abzubrechen. Vermeiden Sie ein übermäßiges Wachstum der Produzentenzelllinie, da sich dies negativ auf die Effizienz der Knochenmarktransduktion auswirkt.
>4. Retrovirale Produzentenzellkultur (Tag 0)
- Platte: 3 x 10:6 retrovirale Produzentenzellen pro 150-mm-Platte, in 18 ml, vollständiges DMEM, 20 % (vol/vol) FBS.
- Retrovirale Produzentenzellen über Nacht bei 37 °C inkubieren. Rechnen Sie mit einer 150-mm-Platte für 15 Millionen Knochenmarkzellen (ca. 2-3 Spendermäuse).
>5. Retroviraler Überstand (Tag 1)
- Am nächsten Tag (ca. 24 Stunden später) wird der retrovirale Überstand von den Erzeugerplatten (in Schritt 4 eingerichtet) entnommen, indem der retrovirale Überstand mit einer 10-ml-Spritze und einem Filter unter Verwendung eines 0,45-μm-Spritzenfilters direkt von der 150-mm-Platte entnommen wird.
- Ersetzen Sie den entfernten retroviralen Überstand vorsichtig durch 18 ml frisches, vollständiges DMEM 20 % (vol/vol) FBS.
- Ergänzen Sie den filtrierten retroviralen Überstand mit IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1), MSCF (50 g ml-1) und Hexadimethrinbromid (Polybrene) (6 μg ml-1).
Anmerkung: Hexadimethrinbromid sollte alle 2 Monate frisch gemacht werden, um einen Abfall der Wirksamkeit der retroviralen Transduktion zu vermeiden.
>6. Retroviraler Überstand und Transduktion (Tag 2)
- Nach 24 Stunden wird frischer Virusüberstand aus der Zelllinie des Virusproduzenten entnommen. Filtrieren Sie den retroviralen Überstand mit einer 10-ml-Spritze und einem 0,45-μm-Spritzenfilter. Ergänzen Sie den filtrierten retroviralen Überstand mit IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) und SCF (50 g ml-1) sowie Hexadimethrinbromid (6 g ml-1).
- Entfernen Sie anschließend vorsichtig mit einer Pipette oder aspirieren Sie die oberen 2 ml des Mediums aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte, die die Knochenmarkzellen enthält.
Anmerkung: Arbeiten Sie vorsichtig, um das Knochenmark nicht zu aspirieren, das sich normalerweise in der Mitte der Vertiefung konzentriert. Alternativ kann der entfernte Überstand heruntergeschleudert werden, um verlorene Knochenmarkzellen wiederherzustellen.
- Zu jeder Vertiefung in der 6-Well-Platte des Knochenmarks werden 3 ml frischer Virusüberstand gegeben, der Zytokine und Hexadimethrinbromid enthält. Wickeln Sie die Platten in Plastik ein und wiederholen Sie die Spintransduktion bei 1.000 x g für 60 min bis 37 °C. Packen Sie die Platten aus und inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO2 über Nacht (ca. 24 h).
>7. Zugabe von frisch ergänztem DMEM (Tag 3)
- Nach 24 Stunden entfernen Sie die oberen 2 ml des Mediums aus jeder Vertiefung der Sechs-Well-Platte, die die Knochenmarkzellen enthält, wie in Schritt 6.2 beschrieben. Ersetzen Sie das entfernte Medium durch frisches DMEM 20 % (vol/vol) FBS, das mit den Endkonzentrationen IL-3 (20 g ml-1), IL-6 (50 g ml-1) und SCF (50 g ml-1) ergänzt wird.
- Inkubieren Sie die Knochenmarkplatten bei 37 °C CO2 -Inkubator für weitere 24 Stunden.
