Ölrot-O-Färbung: Eine Technik zum Färben neutraler Lipide in Hepatozyten zum Nachweis von Lebersteatose in vitro

Zusammenfassung

Quelle: Campos-Espinosa, A. et al., Ein Modell der experimentellen Steatose in vitro: Hepatozyten-Zellkultur in einem Lipidüberladungs-konditionierten Medium. J. Vis. Exp. (2021)

In diesem Video demonstrieren wir in vitro die Färbung von neutralen Lipiden in Hepatozyten, um Lebersteatose oder übermäßige Fettansammlung in der Leber zu erkennen. Überschüssiges Fett sammelt sich in den Zellen in Form von Lipidtröpfchen an. Oil Red O ist ein fettlöslicher Farbstoff, der an intrazelluläre neutrale Lipide in diesen Lipidtröpfchen bindet. Wenn sie unter einem Lichtmikroskop betrachtet werden, erscheinen diese intrazellulären Lipidtröpfchen intensiv rot

.

Protokoll

>1. Lipidfärbung mit Oil-Red O

1. Legen Sie in jede Vertiefung in einer 24-Well-Platte ein Zellkulturdeckglas.
2. Keimen Sie 100.000 HepG2-Zellen pro Well. Fügen Sie 1 ml Standard-RPMI 1640 hinzu.
3. Bei 37 °C und 5 % CO2 für 24 h vorinkubieren.
4. Tauschen Sie das Standardmedium RPMI 1640 gegen das steatogene Medium aus.
5. Inkubieren Sie 24 Stunden, 2 Tage, 3 Tage und 4 Tage und erneuern Sie das steatogene Medium alle 24 Stunden.
6. Entsorgen Sie den Überstand nach der entsprechenden Zeit.
7. Mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen. Entsorgen Sie den Überstand.
8. Fixieren Sie mit 1 mL 4% Paraformaldehyd in PBS.
9. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
10. Entsorgen Sie den Überschuss an Paraformaldehyd.
11. Spülen Sie die Zellen mit 1 mL destilliertem Wasser.
12. 1 ml 70% Isopropanol zugeben und 5 Minuten inkubieren.
13. Entsorgen Sie den Überschuss an Isopropanol. Eine PBS-Wäsche ist zu diesem Zeitpunkt nicht erforderlich.
14. 1 ml ölrote O-Lösung zugeben und 30 Minuten inkubieren.
15. Entsorgen Sie den Überschuss der Öl-roten O-Lösung.
16. Mit 1 mL destilliertem Wasser spülen.
17. Fügen Sie 500 μl Hämatoxylinlösung hinzu. 3 Min. inkubieren.
18. Entsorgen Sie den Überschuss an Hämatoxylinlösung.
19. Mit 1 mL destilliertem Wasser spülen.
20. Beobachten Sie unter dem Mikroskop bei einer Vergrößerung von 400x (Objektiv 40x, Okular 10x).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nährboden RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, USA	Artikel-Nr.: 31800-022	-
Fötales Rinderserum (FBS)	ThermoFisher-Gibco, USA	A4766801	-
HepG2-Zelllinie	ATCC, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. HB-8065	Hepatozelluläres Karzinom menschliche Zellen.
Befeuchteter Inkubator	Thermo Electronic Corporation, USA	Artikel-Nr.: 3110	Temperatur (37 °C ± 1 °C), Luftfeuchtigkeit (90 % ± 5 %), CO2 (5 % ± 1 %)
Inverses Mikroskop Eclipse	NIKON, JPN	Modell: TE2000-S	-
Isopropanol	Sigma-Aldrich, USA	I9030-4L	-
Öl Rot O Kit	Abcam, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: ab150678	Kit für die histologische Darstellung von Neutralfett.
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich, USA	Nr. P6148-500G	-
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher-Gibco, USA	Nr. 15140-122	Antibiotika 10.000 μg/ml Penicillin, 10.000 μg/ml Streptomycin
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	ThermoFisher-Gibco, USA	Nr. 10010-023	-
Serologische Pipetten	Sarstedt, AUS	Artikel-Nr.: 86.1253.001	Nicht pyrogen, steril, 5 mL
Serologische Pipetten	Sarstedt, AUS	Artikel-Nr.: 86.1254.001	Nicht pyrogen, steril, 10 mL
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich, USA	Nr. S5761-1KG	Vorbereitung von Nährmedien
Natriumoleat	Santa Cruz Biotechnologie, USA	sc-215879A	-
Natriumpalmitat	Santa Cruz Biotechnologie, USA	SC-215881	-
Trypsin 0,05 % /EDTA 0,53 mM	Corning, Vereinigte Staaten von Amerika	Artikel-Nr.: 25-052-CL	-
24-Well-Zellkulturcluster	Corning, Vereinigte Staaten von Amerika	3524	Flacher Boden mit Deckel. Behandelte Gewebekultur. Nicht pyrogen, Polystyrol, steril. 1/Packung.

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