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>1. Fluorometrische Quantifizierung von neutralen Lipiden mit Nilrot
HINWEIS: Für die Fluoreszenzmessung werden nur 10 μl einer Algensuspension bei 5 g/l benötigt. Im Allgemeinen ist die Isolierung von Trockenalgenbiomasse aus 1,5 ml Kulturbrühe mehr als ausreichend. Außerdem kann sich die Lichtintensität der Lampe im Spektralphotometer mit der Zeit verschlechtern. Es wird empfohlen, in jedes Experiment Standards aufzunehmen, um sicherzustellen, dass Variationen im Gerät keine unnötigen Fehler bei den Messungen verursachen.
- Bereiten Sie eine Nilrotlösung in einer Konzentration von 10 μg/ml vor, die in Ethanol in Alkoholreagenzqualität gelöst ist. Lagern Sie diese Lösung im Dunkeln bei 4 °C.
- Eine 30%ige (v/v) Ethanollösung in entionisiertem Wasser herstellen und bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie alle Algenproben mit der gleichen Biomassekonzentration (5 g/l wird empfohlen) und auf die gleiche Weise wie die bei der Messung verwendeten Standards vor. Tun Sie dies, indem Sie entweder vorgetrocknete Proben in der entsprechenden Menge Phosphatpuffer suspendieren (0,6 g/l Kaliumphosphat zweibasisch, 1,4 g/l Kaliumphosphat einbasisch) oder indem Sie die Konzentration einer wachsenden Algenkultur auf 5 g/l mit Phosphatpuffer einstellen, nachdem Sie die Trübung gemessen haben.
HINWEIS: Messungen, die an lebenden Algenkulturen durchgeführt werden, sind oft mit größeren Fehlern verbunden, abhängig von der Genauigkeit der Trübungskalibrierungskurve. Bei der Resuspendierung getrockneter Proben kann die Verwendung eines Homogenisators erforderlich sein, um die Biomasse vollständig zu dispergieren.
- Mischen Sie für jede Probe 80 μl der 30%igen Ethanollösung, 10 μl der Nilrotlösung und 10 μl Algensuspension in einer einzigen Vertiefung einer 96-Well-Platte. Um die Variabilität der Fluoreszenzmessung richtig zu berücksichtigen, führen Sie 5 Wiederholungen jeder Probe durch.
- Führen Sie eine Zwei-Punkt-Kalibrierkurve mit Standards durch, um tägliche Schwankungen des Geräts und der Vorbereitung zu berücksichtigen. Bereiten Sie die Standards für die Fluoreszenzmessung mit dem gleichen Verfahren vor wie die Proben.
HINWEIS: Im Allgemeinen sind zwei Punkte für die Rekalibrierung des Geräts ausreichend, drei Punkte können ausgeführt werden, um die Linearität zu überprüfen.
- Führen Sie die Fluoreszenzmessungen in einem Multiwell-Plattenleser-Spektralphotometer durch. Es wurde festgestellt, dass die folgenden Bedingungen die konsistentesten Ergebnisse liefern:
- Schütteln bei 1.200 U/min, Orbit 3 mm, für 30 Sekunden.
Bei - 40 °C 10 min inkubieren.
- Schütteln bei 1.200 U/min, Orbit 3 mm, für 30 Sekunden.
- Aufzeichnung von Fluoreszenz, Anregung bei 530 nm, Emission bei 604 nm.
- Rechnen Sie die Fluoreszenzmessungen mit den Ergebnissen aus den internen Standards in den Ölgehalt um.