Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Reagenzien
- Isolierung und Verkalkung von murinen Aorten-VSMCs
- Lösung für den Aortenaufschluss:
- Bereiten Sie eine frische Lösung (~3-5 ml pro entnommener Aorta) mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) vor, die 175 U/ml Typ-2-Kollagenase und 1,25 U/ml Elastase enthält. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 μm vakuumbetriebenen Filtersystem und halten Sie die Lösung bis zur Verwendung auf Eis.
- Zelluläre Medien:
- Ergänzen Sie 500 ml Modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Erwärmen Sie das Medium vor der Verwendung auf 37 °C.
- Verkalkungsmedien:
- Kalzifizierungsmedium A (NaPhos; wird in Mauszelllinien verwendet):
- Ergänzen Sie 100-500 ml DMEM (Volumen nach Bedarf) mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM Natriumphosphat, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Erwärmen Sie das Medium vor der Verwendung auf 37 °C.
Oder
- Kalzifizierungsmedium B (βGP/Asc/DEX; wird entweder in Maus- oder menschlichen Zelllinien verwendet):
- Ergänzen Sie 100-500 ml DMEM (Volumen nach Bedarf) mit 10 % fötalem Rinderserum, 10 mM β-Glycerophosphat-Dinatrium, 50 μg/ml L-Ascorbinsäure, 10 nM Dexamethason, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Erwärmen Sie das Medium vor der Verwendung auf 37 °C.
>2. Zerlegen der Maus
- Euthanasieren Sie die Maus mit einer intraperitonealen Pentobarbital-Injektion von 200 mg/kg.
- Legen Sie die Rückenlage des Tieres auf das Sezierbrett und stabilisieren Sie es, indem Sie jede Pfote an das Brett kleben. Machen Sie mit einem Präpariermikroskop und einer kleinen Schere einen Schnitt in der Mittellinie, der sich vom Unterbauch bis zum oberen Brustkorb erstreckt.
- Schälen Sie die Haut mit einer Pinzette ab und entfernen Sie das Bauchfell, wodurch die Bauchorgane zum Vorschein kommen. Entfernen Sie die Magen-Darm-Organe und achten Sie darauf, die Aorta nicht zu durchschneiden.
- Machen Sie einen seitlichen Schnitt im vorderen Zwerchfell und setzen Sie den Schnitt über den Bauch fort. Lösen Sie den Brustkorb mit einer Präparierschere, indem Sie die Seiten der Rippen durchschneiden und das Weichgewebe entfernen, das am oberen Teil des Brustbeins haftet. Entfernen Sie den Brustkorb und legen Sie die Lunge frei.
- Lassen Sie das Herz zunächst an Ort und Stelle (um die proximale Aorta zu identifizieren und zu präparieren) und entfernen Sie vorsichtig die Lunge. Entfernen Sie den Thymus, die Luftröhre und die Speiseröhre vorsichtig und stellen Sie sicher, dass die Aorta intakt bleibt.
- Entfernen Sie mit einer geraden feinen Pinzette und einer Mikropräparierschere das die Aorta umgebende Weichgewebe von der Beckenbifurkation bis zum Aortenbogen und achten Sie dabei sorgfältig auf die Entfernung des periaortalen Fetts (Abbildung 1A). Entfernen Sie das restliche Fett und Weichgewebe, das die großen Äste des Aortenbogens umgibt (d. h. die Arteria brachiocephalic, die Arteria carotis communis und die Arteria subclavia, Abbildung 1B).
Anmerkung: Es ist wichtig, das Fett aus der Aorta zu entfernen, da Fett das Hintergrundsignal bei der Fluoreszenzbildgebung verstärken kann.
- Entfernen Sie das Herz aus der Brusthöhle, lösen Sie es vorsichtig von der proximalen Aorta und entsorgen Sie es. Die distale Aorta an der Beckenbifurkation durchschneiden. Injizieren Sie mit einer Insulinnadel normale Kochsalzlösung aus dem Aortenbogen in die Aorta, um die restlichen Blutzellen auszuwaschen. Löse die Aorta zusammen mit den Aortenbogengefäßen und entferne sie vollständig aus dem Körper.
- Legen Sie die Aorta in normale Kochsalzlösung auf Eis, bis sie für die Bildgebung bereit ist.
>3. Isolierung primärer glatter Muskelzellen der Aorta
- Legen Sie die Aorten in kaltes HBSS, bis die Sektionen abgeschlossen sind. Schneiden Sie vorsichtig das restliche periaortale Fett und Weichgewebe ab, so dass nur die Aorta übrig bleibt.
- Unter einer sterilen Gewebekulturhaube werden die Aorten in 35 mm x 10 mm großen Gewebekulturschalen in die Aortenverdauungslösung überführt. 30 Minuten lang bei 37 °C in einen Inkubator stellen und dabei leicht intermittierend schaukeln. Nach der Verdauung zeigen die Aorten ein gedehntes oder ausgefranstes Aussehen.
- Entfernen Sie mit dem Präpariermikroskop und der sterilen Pinzette die äußere Adventitialschicht der Aorta, während die mediale Schicht intakt bleibt. Eine Technik, um die Adventitia zu entfernen, besteht darin, die äußere Schicht der Aorta an einem Ende abzuziehen und sie von der darunter liegenden medialen Schicht zu entfernen, so wie man eine Socke zurückziehen und entfernen könnte.
- Nachdem die Adventitialschicht entfernt wurde, legen Sie die verbleibende Aorta in eine neue Gewebekulturschale mit Zellkulturmedien und lagern Sie sie bei 37 °C mit 5 % CO2 für 2-4 Stunden.
- Unter einer sterilen Haube und mit einer sterilen 3 mm Mikrodissektionschere die Aorta in 1-2 mm breite Ringe schneiden.
- Legen Sie diese Ringe in eine neue Gewebekulturschale mit Aortenaufschlusslösung und inkubieren Sie sie bei 37 °C unter leichtem intermittierendem Schaukeln für 120 Minuten. Pipettieren Sie die Lösung während dieser Inkubation mehrmals auf und ab, um die Zellen wieder zu suspendieren.
- 5 ml warmes Zellkulturmedium in die Aufschlusslösung geben und in ein konisches 15-ml-Röhrchen umfüllen.
- Zentrifugieren Sie das Röhrchen 5 min lang bei 200 x g.
- Aspirieren Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen im gewünschten Volumen des Zellkulturmediums (z. B. 5 ml).
- Die gesamte Menge der isolierten Zellen aus jeder Aorta wird in einen 25 cm 2-Zellkulturkolben gegeben und bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Vermehren Sie Zellen mit Standardtechniken, wie zuvor beschrieben. Wechseln Sie während der ersten 7-10 Tage der Inkubation das Medium alle 72-96 Stunden. Wenn sich die Zellen der Konfluenz nähern, füllen Sie das Medium häufiger auf (alle 48 Stunden).
Anmerkung: Es kann viele Wochen dauern, bis eine ausreichende Menge an Zellen gezüchtet ist.
- Sobald es zusammenfließt, passieren Passagezellen mit Trypsin, das auf 37 °C erwärmt wird.
- 0,5-1,0 ml Trypsin in jeden Kulturkolben geben und 3-5 Minuten inkubieren; klopfen Sie bei Bedarf alle 30-60 Sekunden vorsichtig auf die Seite des Kolbens, um die Zellen von der Oberfläche zu lösen.
- Sobald sich die Zellen vom Boden des Kolbens gelöst haben, werden 10 ml Zellmedium zu den Zellen in Trypsin gegeben. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min. Aspirieren Sie das Medium und Trypsin aus dem Zellpellet. Die Zellen werden in der gewünschten Menge an frischem Zellmedium (z. B. 5-10 ml) resuspendiert und in einen neuen Kolben überführt (wobei einige Zellen auf einen Kammerobjektträger übertragen werden).
- Bei der ersten Passage von Zellen bestätigen Sie die Abstammung der glatten Muskelzellen mit immunzytochemischen Standardtechniken, wie zuvor beschrieben, unter Verwendung eines Antikörpers, der gegen α-glatte Muskelaktin gerichtet ist.
>4. Induktion der Verkalkung von kultivierten glatten Muskelzellen
- Plattenzellen, gewonnen aus 3.12 in einem 6-Well-Format.
Anmerkung: Beginnend mit 1 x 10werden 5 Zellen/Well bei einem Gesamtvolumen von 2,0 ml Zellmedien pro Well empfohlen.
- Lassen Sie die Zellen mindestens 7 Tage lang in einem 6-Well-Plattenformat in Verkalkungsmedium A oder B wachsen. Die Zellen werden bei 37 °C mit 5 % CO 2 inkubiert.
- Wechseln Sie das Mobilfunkmedium alle 48 Stunden.
>5. Beurteilung der VSMC-Verkalkung mit der von-Kossa-Färbemethode
HINWEIS: Die von-Kossa-Methode zur Messung der extrazellulären Matrixverkalkung von Geweben oder kultivierten Zellen basiert auf der Substitution von phosphatgebundenen Calciumionen durch Silberionen. In Gegenwart von Licht und organischen Verbindungen werden die Silberionen reduziert und als metallisches Silber visualisiert. Nicht umgesetztes Silber wird durch Behandlung mit Natriumthiosulfat entfernt. Das Protokoll für die von-Kossa-Färbung lautet wie folgt:
- Aspirieren Sie Medien aus Zellkulturplatten.
- Fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie 20 Minuten lang in 1 ml 10% Formalin bei Raumtemperatur legen.
- Entfernen Sie das Formalin und waschen Sie die fixierten Zellen 5 Minuten lang mit destilliertem Wasser.
- Inkubieren Sie die Zellen in 1 ml 5%iger Silbernitratlösung unter einer 60-100 W Glühbirne für 1-2 Stunden.
- Die Silbernitratlösung aspirieren und 5 Min. mit destilliertem Wasser waschen.
- Entfernen Sie nicht umgesetztes Silber, indem Sie die Zellen 5 Minuten lang in 1 ml 5%ige Natriumthiosulfatlösung (w/v) in destilliertem Wasser legen.
- Spülen Sie die Zellen 5 Minuten lang mit destilliertem Wasser. Wiederholen Sie die Waschgänge 3x. Der von Kossa-Farbstoff ist bereit für die Bildgebung mit der Standard-Inverslichtmikroskopie.
- Optionaler Schritt: Mit 1 ml nuclear fast red für 5 min gegenfärben. Anschließend drei Wäschen mit destilliertem Wasser (jeweils 5 min).
