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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Protokoll zur Eosin-Färbung
- Um Weichteilproben zu fixieren, füllen Sie ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit einer Fixierlösung, die 9,5 ml 4%ige (v/v) Formaldehydlösung (FA) und 0,5 ml Eisessig (AA) enthält.
Anmerkung: Bereiten Sie die FA-Lösung frisch aus einer 37 % säurefreien FA-Lösung her, die mit ca. 10 % Methanol stabilisiert ist. Verdünnen Sie die FA-Lösung weiter mit der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco. Wählen Sie DPBS ohne Kalzium und Magnesium. Bewahren Sie die verdünnte FA-Lösung nicht länger als einen Monat auf. Während der Ansäuerung ändert sich der pH-Wert der Fixierlösung von neutral auf ca. 3,
Vorsicht: Da FA akut organtoxisch, ätzend und krebserregend ist, ist die Verwendung eines Abzugs obligatorisch und es muss eine geeignete persönliche Schutzausrüstung verwendet werden.
- Geben Sie die frisch entnommene Weichteilprobe in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und kühlen Sie das 50-ml-Zentrifugenröhrchen für 24-72 Stunden.
Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden.
- Waschen Sie die Weichteilprobe 1 Stunde lang mit DPBS-Lösung.
- Um die fixierte Weichteilprobe (z. B. eine ganze Mausniere) zu färben, legen Sie das Weichgewebe in 2 mL Eosin-Y-Färbelösung und inkubieren Sie die Probe 24 Stunden lang. Bewahren Sie die Probe während des Inkubationsprozesses auf einer horizontalen Schüttelplatte auf, um ein sanftes Schaukeln (ca. 60 U/min) zu gewährleisten.
Anmerkung: Die Eosin Y-Färbelösung hat eine Konzentration von 30 % (w/v) in destilliertem Wasser. Wählen Sie das Volumen der Färbelösung so, dass die Probe vollständig von der Färbelösung bedeckt ist und sich die Probe frei im Probenbehälter bewegen kann. Die Inkubationszeit kann bei anderen Proben abweichen und muss entsprechend angepasst werden.
- Entnehmen Sie die Weichteilprobe nach dem Färben vorsichtig aus dem Probenbehälter.
- Überschüssiges Fleckenmittel vorsichtig mit Zellulose-Seidenpapier entfernen.
- Die Weichteilprobe wird zur Lagerung und weiteren Verwendung in einen konischen Probenbehälter über einer Ethanoldampfphase gelegt.
Anmerkung: Der konische Probenbehälter muss immer einige Tropfen 70 % (v/v) Ethanol am Boden des Röhrchens enthalten, um die Weichteilprobe feucht zu halten und Artefakte zu vermeiden.