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>1. Herstellung von Färbelösungen
- Harris Hämatoxylin-Stammlösung filtrieren, um alle festgefallenen Feststoffe zu entfernen.
- Falten Sie einen Kaffeefilter in der Mitte, so dass der Filter einen Kegel bildet. Öffnen Sie die Seitenwand, so dass die Flüssigkeit durch den Filter läuft und Schmutz aufgefangen werden kann.
- Setzen Sie den Filter in einen Trichter und den Trichter in eine Glasmedienflasche ein. Gießen Sie nach und nach das vorrätige Hämatoxylin durch den Filter.
Vorsicht: Hämatoxylin ist gefährlich bei Augenkontakt, Verschlucken und Einatmen. Tragen Sie immer einen Laborkittel und Handschuhe und fassen Sie die Stammlösung in einer chemischen Haube an.
- 0,05 % HCl werden durch Zugabe von 125 μl 12 N HCl zu 250 mL ddH2O hergestellt.
- Bereiten Sie eine Mischung aus Eosin-Y-Phloxin B-Lösung vor, indem Sie 25 ml 1 % Eosin Y (aq), 2,5 ml 1 % Phloxin B (aq), 195 ml 95 % Ethanol und 1 ml Eisessig in einer Glasflasche kombinieren. Durch Schwenken gut mischen und bei RT
aufbewahren
Vorsicht: Eosin Y ist gefährlich bei Augenkontakt, Verschlucken und Einatmen. Tragen Sie immer einen Laborkittel und Handschuhe und fassen Sie die Stammlösung in einer chemischen Haube an.
- Bereiten Sie 2%iges Ethanol vor, indem Sie 2 ml reinen Ethylalkohol zu 98 ml Eiwasser hinzufügen.
Vorsicht: Ethylalkohol ist ein Augenreizmittel. Tragen Sie beim Umgang mit Ethylalkohol immer die richtige Schutzausrüstung. Es ist auch brennbar und sollte entsprechend gehandhabt und gelagert werden.
HINWEIS: Bereiten Sie jedes Mal frisches 2%iges Ethanol vor, bevor Sie die akute Ethanolbehandlung durchführen.
>2. Hämatoxylin- und Eosinfärbung von Paraffinschnitten
- Entparaffinieren Sie die Objektträger, indem Sie sie 15 Minuten lang in 100 % Xylol tauchen, und wechseln Sie sie für weitere 15 Minuten in frisches 100 % Xylol.
- Rehydrieren Sie die Objektträger, indem Sie sie durch die folgende Reihe von sortiertem Ethanol tauchen, bis die Flüssigkeit sauber von den Objektträgern abläuft. Für jede Lösung 8-10 Mal eintauchen, 2 s pro Dip: 100 % Ethanol, 100 % Ethanol, 95 % Ethanol, 95 % Ethanol, 70 % Ethanol, 50 % Ethanol, 30 % Ethanol und entionisiertes Wasser.
Anmerkung: Hier kann das Protokoll gestoppt werden, und die Objektträger können bei RT für mehrere Stunden im Wasser belassen werden. Bei Bedarf können die Objektträger bei 4 °C in Wasser O/N gelagert werden.
- Legen Sie die Objektträger für 4 Minuten in 100% gefiltertes Harris-Hämatoxylin und geben Sie sie sofort wieder in den Behälter mit deionisiertem Wasser. Lassen Sie entionisiertes Wasser in die hintere Ecke des Behälters laufen, die am weitesten von den Abschnitten entfernt ist. Leeren Sie den Behälter regelmäßig, bis das Wasser nicht mehr violett ist.
Anmerkung: Lassen Sie das Wasser nicht direkt auf die Rutschen laufen, da sich die Teile von den Rutschen lösen können.
- Überprüfen Sie schnell die Hämatoxylinintensität an einem Präpariermikroskop mit Schwanenhalslichtern; lassen Sie die Objektträger nicht trocknen. Wenn der Fleck die gewünschte Intensität erreicht hat, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn die Farbe nicht dunkel genug ist, legen Sie die Objektträger 1 Minute lang in 100% Hämatoxylin und wiederholen Sie die Wasserwaschungen, bevor Sie erneut überprüfen.
Anmerkung: Das Hämatoxylin muss dunkel genug sein, damit die Farbe bei der Eosinfärbung nicht verloren geht. Wenn jedoch eine Hämatoxylin-Färbung im Zytoplasma zu sehen ist, sind die Schnitte überfärbt.
- Tauchen Sie die Objektträger zweimal in 0,05 % HCl und geben Sie sie sofort wieder in den Behälter mit sauberem, entionisiertem Wasser. Leeren Sie das Wasser und füllen Sie den Behälter zweimal mit Wasser.
- Übertragen Sie die Objektträger für 30 s auf 95% Ethanol und dann für 30 s auf einen neuen Behälter mit 95% Ethanol
.
- Legen Sie die Objektträger für 2 Minuten in die Eosin-Y-Phloxin-B-Lösung. Übertragen Sie die Objektträger zurück in den vorherigen 95%igen Ethanolbehälter und überprüfen Sie schnell die Intensität der Farbe unter dem Präpariermikroskop. Wenn die Färbung ausreicht, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Wenn nicht, kehren Sie für 30 s zur Eosinlösung zurück, überprüfen Sie sie erneut und wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf.
Anmerkung: Eine ausreichende Eosinfärbung ist hellrosa und steht in deutlichem Kontrast zur Hämatoxylin-Färbung. Achten Sie darauf, die Lösung von der Rückseite der Objektträger abzuwischen, wenn Sie sie unter dem Mikroskop überprüfen, damit keine falschen Farben beobachtet werden. Da Eosin zu 95 % aus Ethanol besteht, kann bei längerer Zeit mit 95 % Ethanol bei der Überprüfung der Farbintensität ein Teil der Farbe ausgelaugt werden.
- Übertragen Sie die Objektträger für 15 s auf 100 % Isopropanol. Ersetzen Sie sie durch frisches 100 % Isopropanol und legen Sie die Objektträger für weitere 15 s wieder in das Isopropanol. Wiederholen Sie diesen Vorgang für insgesamt 6 Isopropanol-Wäschen.
Vorsicht: Isopropanol ist ein Reizmittel für Augen und Atemwege. Achten Sie immer darauf, die richtige Schutzausrüstung zu tragen und Spritzer zu vermeiden. Es ist zudem leicht entflammbar und sollte entsprechend gelagert und gehandhabt werden.
Anmerkung: Um Reagenzien zu sparen, entsorgen Sie nur die erste (rosafarbenste) Isopropanol-Wäsche. Bewahren Sie die anderen fünf Waschlösungen in Flaschen mit den Nummern 1 bis 5 auf, um sie für die nächste Färbung wiederzuverwenden. Beginnen Sie bei der Wiederverwendung von Waschmitteln mit der Flasche mit der Nummer "1" und entsorgen Sie sie nach Gebrauch. Sobald Wäsche "2" verwendet wurde, gießen Sie sie in die Flasche "1" und so weiter. Die letzte Wäsche sollte immer frisches Isopropanol sein.
- Legen Sie die Objektträger für 3 Minuten in 100% Xylole. Entfernen Sie einen Objektträger nach dem anderen und legen Sie ein Deckglas an.
- Geben Sie ausreichend Einbettmedium hinzu, um die Abschnitte abzudecken, und tauchen Sie sie in 100% Xylol.
Anmerkung: Dieser Schritt glättet die Oberfläche des Eindeckmediums und entfernt alle Blasen.
- Bringen Sie ein Deckglas am unteren Rand der Folie an.
Anmerkung: Das Montagemedium sollte die Schiene in Position bringen. Wenn das Deckglas nicht gerade oder nicht vollständig sitzt, klopfen Sie es vorsichtig ein.
- Tupfen Sie überschüssiges Eindeckmedium auf ein Papiertuch, bis nur noch eine dünne Linie zu sehen ist. Tauchen Sie ein Taschentuch in das Xylol und wischen Sie die Rückseite des Objektträgers ab, um das abgetropfte Medium zu entfernen. Legen Sie die Folie flach auf eine stabile, aber bewegliche Oberfläche, z. B. ein Stück Pappe. Decken Sie alle restlichen Dias auf die gleiche Weise ab. Lassen Sie das Xylol 10 Min. in der Haube verdunsten< />
Anmerkung: Mit Xylol kontaminierte Materialien sollten entfernt und in einem verschlossenen Behälter in der Haube entsorgt werden, um ein Entweichen von Dämpfen zu verhindern.
- Lassen Sie das Einbettmedium bei RT O/N aushärten.
>3. Bildgebung und Lagerung von gefärbten Objektträgern
- Bildausschnitte an einem zusammengesetzten inversen Mikroskop.
Anmerkung: Objektträger können unbegrenzt bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.