Methylenblau-Färbung zur Beurteilung der Bildung metastasierender Kolonien in vitro: Ein Färbeverfahren zur Beurteilung der Metastasierung durch Quantifizierung geernteter Krebszellen aus einem Krebsmausmodell

Zusammenfassung

Quelle: Nagai-Singer, M. A., et al. Verwendung computerbasierter Bildanalyse zur Verbesserung der Quantifizierung von Lungenmetastasen im 4T1-Brustkrebsmodell. J. Vis. Exp. (2020)

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Methylenblau-Färbung, um die Metastasierungslast zu quantifizieren, indem wir gefärbte Kolonien zählen, die durch die Kultivierung von Krebszellen gewonnen wurden, die nach der Injektion aus entfernten Organen eines Mausmodells entnommen wurden.

Protokoll

Alle Tiermodellverfahren wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.

>1. Verarbeitung von Geweben

HINWEIS: Alle Schritte in diesem Abschnitt sollten mit steriler Technik durchgeführt werden.

1. Markieren Sie 1 konisches Röhrchen zu 15 ml pro Maus und geben Sie 2,5 ml Kollagenase-Mischung vom Typ IV und 30 Einheiten Elastase in jedes Röhrchen. Um eine Kollagenasemischung vom Typ IV herzustellen, lösen Sie 2 mg Kollagenase vom Typ IV pro ml 1x HBSS und Sterilfilter. Dieser kann bis zu 12 Monate bei -20 °C gelagert und bei Bedarf aufgetaut werden.
2. Übertragen Sie die entnommene Mauslunge in die zweite, 1x HBSS-Vertiefung für diese Probe. Mit einer Pinzette schwenken, um das restliche Blut zu entfernen. Übertragen Sie die saubere Lunge auf eine leere 3,5-cm-Gewebekulturplatte. Lunge mit einer Schere hacken. Spülen Sie die Platte mit 2,5 mL 1x HBSS, geben Sie 1x HBSS und Lungenstücke in ein konisches 15-ml-Röhrchen, das bereits einen Kollagenase/Elastase-Cocktail enthält (insgesamt 5 mL).
3. 75 Minuten bei 4 °C inkubieren. Während dieser Zeit die Proben weiter mischen, die Röhrchen auf eine Wippe oder ein rotierendes Rad legen. Während dieses Inkubationsschritts werden für jede Maus 50 ml-Zentrifugenröhrchen und 10 cm große Gewebekulturplatten etikettiert. Wenn Sie eine Verdünnung durchführen, beschriften Sie genügend 10 cm große Gewebekulturplatten für die Verdünnungen.
   Anmerkung: Beschriften Sie den Deckel der Gewebekulturplatten. Wenn die Platte selbst beschriftet wird, beeinträchtigt die Beschriftung die Fiji-ImageJ-Analyse.
4. Erhöhen Sie das Volumen jedes Röhrchens auf insgesamt 10 mL mit 1x HBSS. Gießen Sie den Inhalt über ein 70-μm-Zellsieb in ein konisches 50-ml-Röhrchen für jede Probe. Verwenden Sie den Kolben einer 1-ml-Spritze, um die Probe vorsichtig durch das Sieb zu mahlen, damit mehr Zellen durchsickern können.
5. 5 Minuten bei 350 x g bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 10 mL 1x HBSS. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
6. Resuspendieren Sie das Pellet in 10 mL 60 μM 6TG Komplettkulturmedium, entweder RPMI oder IMDM. Proben in 10-cm-Zellkulturplatten plattieren, auf Wunsch mit einem Verdünnungsschema. Bei 37 °C, 5 % CO₂ 5 Tage inkubieren.
   HINWEIS: 1:2, 1:10 und 1:100 sind gängige Verdünnungen, die auf der Grundlage von Studienparametern empirisch bestimmt werden müssen.
   ACHTUNG: 6TG ist giftig. Seien Sie vorsichtig bei der Handhabung und befolgen Sie alle Umwelt-, Gesundheits- und Sicherheitsrichtlinien für die Entsorgung.

>2. Färbeplatten

1. Gießen Sie das Nährmedium von den Platten in den entsprechenden Abfallbehälter. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 5 ml unverdünntes Methanol pro Platte hinzufügen und 5 Minuten lang bei RT inkubieren, wobei Sie darauf achten, dass das Methanol so geschwenkt wird, dass es die gesamte Platte bedeckt.
   Vorsicht: Methanol ist gefährlich, wenn es verschluckt, eingeatmet oder auf der Haut aufgetragen wird. Verwenden Sie für diesen Schritt einen Abzug.
2. Gießen Sie Methanol von den Platten in den entsprechenden Abfallbehälter. Spülen Sie die Platten mit 5 mL destilliertem Wasser pro Platte aus und gießen Sie Wasser in den entsprechenden Abfallbehälter. Fügen Sie 5 ml 0,03 % Methylenblau pro Platte hinzu und inkubieren Sie 5 Minuten lang bei RT, wobei Sie darauf achten, die Methylenblaulösung so zu schwenken, dass sie die gesamte Platte bedeckt.
3. Gießen Sie Methylenblau in den entsprechenden Abfallbehälter. Spülen Sie die Platten erneut mit 5 mL destilliertem Wasser pro Platte. Drehen Sie die Teller auf den Kopf und tupfen Sie sie auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Teller auf den Deckel legen und über Nacht bei RT.
   an der Luft trocknen lassen Anmerkung: Metastasierende Kolonien sind blau. Sobald die Platten getrocknet sind, können sie unbegrenzt bei RT gelagert werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Methanol	Fisher Scientific	Nr. A412SK-4
Methylenblau	Sigma-Aldrich	03978-250ML
RMPI-1640 Mittel	ATCC	30-2001
Wippe oder rotierendes Rad	jegliche	jegliche
Steriler Einwegfilter mit PES-Membran	ThermoFisher Scientific	Tel.: 568-0010
Kollagenase Typ IV	Sigma-Aldrich	Nr. C5138
3,5 cm Gewebekulturplatten	Nunklon	153066
10 cm Gewebekulturplatten	Fisher Scientific	Tel.: 08-772-22
15 mL Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Hank's ausgewogene Kochsalzlösung (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
50 mL Zentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	14-959-49A
70 μM Zellsieb	Fisher Scientific	Tel.: 22-363-548
70% Ethanol	Sigma Aldrich	Nr. E7023	Mit DI-Wasser auf 70 % verdünnen
Brutkasten			Muss 5 % CO2 und 37 °C aufnehmen können
Zange	Roboz	RS-8100
Zentrifuge	jegliche	jegliche	Muss in der Lage sein, 125 x g und 300 x g
destilliertes Wasser	jegliche	jegliche
Elastase	MP Biomedizin	100617

zu verarbeiten