Periodische Säure-Schiff-Färbung von Zellen: eine in vitro Technik zum Nachweis des Glykogenspiegels in mononukleären Zellen des peripheren Blutes

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. PBMC-Isolierung aus Vollblut

HINWEIS: Führen Sie dieses Verfahren in einer Biosicherheitswerkbank mit steriler Technik und vom Hersteller sterilisierter Ausrüstung durch.

1. Gießen Sie vorsichtig 10-15 ml Vollblut aus den heparinisierten (gerinnungshemmenden) Blutentnahmeröhrchen in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen. Bei leichten Blutverschüttungen mit ddH₂O und 70% EtOH mit einem Reinigungstuch abwischen.
2. Verdünnen Sie das Blut im konischen Röhrchen im Verhältnis 1:1 mit Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS 1x) pH 7,4. Stellen Sie sicher, dass das maximale Gesamtvolumen 30 ml nicht überschreitet.
3. Vorsichtig mit einer serologischen Pipettenpistole mischen, ohne Blasen zu bilden.
   Anmerkung: Mischen Sie NICHT, indem Sie das Röhrchen umdrehen, um Blutansammlungen in der Kappe und ein anschließendes Versickern während der Zentrifugation zu vermeiden.
4. 13 ml Ficoll-Paque (siehe Materialtabelle) in ein neues konisches Röhrchen mit einem Fassungsvermögen von 50 ml geben. Halten Sie das Rohr aufrecht im Gestell.
5. Entnehmen Sie mit einer Transferpipette verdünntes Blut und berühren Sie die Spitze der Transferpipette mit der Innenwand des Röhrchens in der Nähe der Oberseite. Übertragen Sie das Blut mit langsamem und gleichmäßigem Druck entlang der Innenwand des Röhrchens, wodurch eine Blutschicht über der Saccharoseschicht gebildet wird. Führen Sie diesen Schritt mehrmals aus, bis das gesamte Blut übertragen wurde.
6. Verschließen Sie das Röhrchen fest und zentrifugieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 700 x g in einem Ausschwingrotor mit mittlerer Beschleunigung auf 5 und Verzögerung auf NULL.
7. Nehmen Sie die Tube langsam heraus und bringen Sie sie, ohne die Schichten zu stören, zurück in die Biosicherheitswerkbank.
8. Entnehmen Sie vorsichtig den Buffy Coat (dünne trübe weiße Schicht), in dem sich die PBMCs befinden, und platzieren Sie ihn mit einer Transferpipette zwischen den PBS/Plasma- und Ficoll-Schichten. Vermeiden Sie das Sammeln von Saccharoseschicht und stören Sie nicht die Schicht der roten Blutkörperchen.
9. Übertragen Sie den Buffy Coat in ein neues steriles konisches 50-ml-Röhrchen. Es kann mehrere Male dauern, bis Schritt 1.8 wiederholt wird, um alle PBMC zu sammeln.
10. Geben Sie PBS pH 7,4 in das Röhrchen mit dem PBMC und füllen Sie es bis zur 45 ml-Markierung. Tube gründlich schütteln. Nicht wirbeln.
11. Waschgang 1: 15 min lang bei 480 x g zentrifugieren, wobei sowohl die maximale Beschleunigung als auch die Verzögerung auf 9 eingestellt sind. Beobachten Sie die Bildung eines Pellets aus PBMCs am Boden des konischen Rohrs.
12. Entsorgen Sie das PBS (Überstand) in ein Plastikbecherglas mit 10 ml Bleichmittel.
13. Lösen Sie das Zellpellet, indem Sie es vorsichtig gegen eine wellige Oberfläche (z. B. leeres Rack) "abfüllen". Nicht wirbeln.
14. Geben Sie 25 ml frisches PBS pH 7,4 in das Röhrchen. Wenn mehr als ein Rohr verarbeitet wird, poolen Sie die Pellets in diesem Schritt.
15. Waschgang 2: Zentrifugieren Sie das Röhrchen 12 Minuten lang bei 480 x g, wobei sowohl die maximale Beschleunigung als auch die Verzögerung auf 9 eingestellt sind.
16. Gib das PBS (Überstand) mit einem Spritzer Bleichmittel in das Plastikbecherglas.
17. Sanft gegen eine wellige Oberfläche (z. B. leeres Rack) "racken". Nicht wirbeln.
18. Geben Sie 25 ml frisches PBS in die Tube.
    1. Nehmen Sie 50 μl der Zellen heraus und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen, um die Lebensfähigkeit zu zählen.
    2. Fügen Sie eine gleiche Menge (50 μl) Trypanblau (ein Viabilitätsfleck) hinzu und pipettieren Sie auf und ab, um vorsichtig zu mischen.
19. Nehmen Sie 10 μl heraus und übertragen Sie sie auf ein Hämozytometer, um die Lebensfähigkeit der Zellen pro ml zu überprüfen. Notieren Sie die Anzahl der Zellen/ml.
20. Nehmen Sie die gewünschte Menge an Zellen heraus und zentrifugieren Sie das Röhrchen 12 Minuten lang bei 480 x g, wobei sowohl die maximale Beschleunigung als auch die Verzögerung auf 9 eingestellt sind.
21. Das PBS (Überstand) mit Bleichmittel in das Becherglas geben.
22. Sanft gegen eine wellige Oberfläche (z. B. leeres Rack) "racken". Geben Sie 80 μl PBS in das Röhrchen.

>2. Die PBMC-Folie erstellen

1. Geben Sie 80 μl der Zellen auf einen Objektträger. Verschmieren Sie den Tropfen mit Hilfe eines weiteren Objektträgers oder geben Sie 2 Tropfen à 40 μl auf beide Enden des Objektträgers.
2. Lassen Sie das Objektträger in der biologischen Sicherheitswerkbank trocknen. Beschriften Sie die Folie mit einem Bleistift auf der mattierten Seite.

>3. Fixieren der Proben auf den Objektträgern

1. Bereiten Sie die Fixierlösung vor, indem Sie 0,5 ml 37 % Formaldehyd mit 4,5 ml 99 % Ethanol mischen.
2. Nachdem die Objektträger getrocknet sind, nehmen Sie 2 ml der frisch hergestellten Fixierlösung heraus und gießen Sie sie auf den Objektträger, so dass die gesamte Oberfläche des Objektträgers bedeckt ist.
3. Lassen Sie die Lösung 1 Minute lang auf dem Objektträger. Spülen Sie den Objektträger 1 Minute lang mit Leitungswasser ab und lassen Sie ihn an der Luft trocknen.

>4. Herstellung der Amylase-Lösung für die Negativkontrolle

1. Nehmen Sie 0,25 g Amylasepulver und lösen Sie es in 50 ml destilliertem Wasser auf. Gießen Sie die Lösung in ein sauberes 100-ml-Becherglas.
2. Tauchen Sie den Objektträger so in das Becherglas, dass die Hälfte des Objektträgers die Behandlung erhält und die andere Hälfte unbehandelt bleibt, und inkubieren Sie dann 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (Abbildung 1C).
3. Notieren Sie sich, auf welcher Seite des Objektträgers die Amylase-Behandlung erfolgt. Zeichnen Sie auf der Rückseite des Objektträgers eine Linie, die die Grenze zwischen Behandlung und Kontrolle anzeigt.
4. Waschen Sie die Objektträger mit ddH₂O, um die Amylaselösung zu entfernen, und lassen Sie den Objektträger an der Luft trocknen.

>5. Führen Sie periodische Säureschiff (PAS) Färbung und Bildgebung durch

HINWEIS: PAS-Reagenzien sind giftig beim Einatmen und korrosiv, daher müssen die Schritte in einem chemischen Abzug durchgeführt werden, und die Abfallprodukte müssen gemäß den institutionellen Richtlinien ordnungsgemäß entsorgt werden.

1. Legen Sie den Objektträger auf eine ebene Fläche und gießen Sie 1,50-2,00 ml Periodic Acid Solution auf die Probe. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
2. Spülen Sie die Objektträger in mehreren Füllungen destilliertem Wasser ab.
3. Gießen Sie 1,50-2,00 ml Schiff-Reagenz auf den Objektträger und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
4. Waschen Sie den Objektträger 5 Minuten lang mit destilliertem Wasser und lassen Sie ihn an der Luft trocknen.
5. Tragen Sie 10 μl Eindeckmittel auf den Objektträger und die Abdeckung mit zwei kleinen Deckgläsern auf oder tragen Sie 50 μl auf und verwenden Sie ein großes Deckglas.
6. Klarlack auf die Ränder des Deckglases auftragen und über Nacht trocknen lassen.

>6. Bilder mit dem binokularen Lichtmikroskop mit dem 100X Objektiv aufnehmen

Abbildung 1: Schritt-für-Schritt-Methodik der PAS-Färbung auf PBMC.(A) Zuerst wird die Isolierung von PBMC durch einen Ficoll-Gradienten erreicht, das linke Feld zeigt die Vorbereitung vor der Zentrifugation, das rechte Bild zeigt es nach der Zentrifugation, wobei die Buffy-Schicht, die das PBMC enthält, in der Mitte des Röhrchens beobachtet wird. (B) Isolierte PBMCs werden mit Hilfe einer Formalin-Ethanol-Fixierlösung auf dem Objektträger fixiert. Die Rutsche wird vorsichtig mit destilliertem Wasser aus einer Plastikwaschflasche gespült. (C) Der Objektträger wird dann in ein 100-ml-Becherglas gegeben, das zur Hälfte mit Amylaselösung gefüllt ist, die Glykogen auflöst. Die Schiene wird schonend gespült. (D) Der Objektträger wird mit periodischer saurer Lösung behandelt, in der die Oxidation von Sacchariden stattfindet. Die Objektträger werden schonend gespült; Dadurch wird die überschüssige periodische Säure entfernt und der Oxidationsschritt gestoppt. (E) Wenn das Schiff-Reagenz zu den Objektträgern hinzugefügt wird, reagiert es mit Aldehyden, die während des Oxidationsschritts entstehen. Dieses farblose Reagenz führt dann zu einem tiefroten magentafarbenen Produkt. Die Objektträger werden vorsichtig gespült, um das überschüssige Schiff-Reagenz zu entfernen.