Kresylviolett-Färbung von Gewebeschnitten: Ein Färbeverfahren zur Visualisierung von Knorpel und Knochen in gefrorenen Mausembryonenschnitten

Zusammenfassung

Quelle: Wu, Meng, et al., Laser-Capture-Mikrodissektion von embryonalem Knorpel und Knochen der Maus für die Genexpressionsanalyse. J. Vis.(2019)

Dieses Video beschreibt das Verfahren zur Färbung von Kresylviolett zur Visualisierung von Knochen und Knorpel in koronalen Schnitten von gefrorenen Mausembryonen. Diese Färbetechnik hilft, Knochen und Knorpel mit unterschiedlichen Farben vom umgebenden Gewebe zu unterscheiden.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Probenvorbereitung für die Laser-Capture-Mikrodissektion

1. Bereiten Sie Lösungen für Flecken und Austrocknung vor.
   1. Geben Sie 45 ml 80%iges Ethanol in jedes der drei 50-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis. Beschriften Sie sie als #1, #2 und #3. Verdünnen Sie Ethanol mit RNase/DNase-freiem Wasser.
   2. 45 ml 95%iges Ethanol in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis geben.
   3. 45 ml 100 % Ethanol in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis geben.
   4. 45 mL Xylol werden in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur gegeben.
      ACHTUNG: Xylol sollte in einem Abzug verwendet werden.
2. Tauen Sie einen PEN-Membranobjektträger kurz auf, indem Sie ihn gegen eine behandschuhte Hand legen, waschen Sie ihn dann zweimal für jeweils 30 s in 45 mL 80 % Ethanol (#1 und #2) und rühren Sie ihn in 50 mL Zentrifugenröhrchen auf, um das OCT.
   HINWEIS: Es ist wichtig, das OCT vor dem Färben zu entfernen, um zu verhindern, dass das während des Färbens gelöste OCT die Abschnitte verdeckt. Eine Pinzette kann verwendet werden, um die Entfernung von OCT zu erleichtern, die nicht durch Rühren abgewaschen wird.
3. Legen Sie die Folie auf ein Blatt Alufolie. 0,8 ml 0,1 % Kresylviolett in 50 % Ethanol auf den Objektträger pipettieren und 30 s lang färben. Waschen Sie den Objektträger 30 s lang in 45 ml 80 % Ethanol (#3) und dehydrieren Sie dann durch Durchgang für jeweils 30 s durch 45 ml 95 % Ethanol, 100 % Ethanol und Xylol in 50 mL Zentrifugenröhrchen.
4. Stehen Sie die Folien 5 Minuten lang auf einem Feinfühler, um das Xylol abzutropfen und die Schnitte zu trocknen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zentrifugenröhrchen	ThermoFisher Scientific	339653	Konische sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen, 50 mL
Cresylviolettes Acetat	Sigma-Aldrich	Nr. C5042
Feinfühliger Arbeitswischer	ThermoFisher Scientific	Tel. 06-666
destilliertes Wasser	Invitrogen	Tel.: 10977-015	DNase/RNase-frei
Ethanol, absolut (200 proof)	ThermoFisher Scientific	Nr. BP2818	Molekularbiologie
Glas-PEN-Membranfolie	Leica Mikrosysteme	11505158
OCT-Verbindung	Elektronenmikroskopie	Tel.: 102094-106
RNase Dekontaminationsmittel	Sigma-Aldrich	Nr. R2020	RNase Dekontaminationsmittel zur Reinigung von Oberflächen
Xylol	Sigma-Aldrich	214736