Kristallviolett-Färbung: Eine Technik zur Visualisierung arzneimittelresistenter Krebszellen mit Hilfe von Koloniebildungs-Assays

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Mohr, L. et al., Generation von Prostatakrebszellmodellen der Resistenz gegen das Antimitotikum Docetaxel. J. Vis. Exp. (2017)

In diesem Video demonstrieren wir einen Zellviabilitätsassay mit einem Kristallviolett-Färbeverfahren für chemotherapeutisch resistente Krebszellen.

Protokoll

>1. Funktionelle Charakterisierung der erworbenen Docetaxel-Resistenz durch Koloniebildungsassay

HINWEIS: In diesem Protokoll wurde die Chemoresistenz mit Hilfe von Koloniebildungsassays bewertet. Alternative Methoden zur Bewertung der Zellviabilität (z. B. MTS-Assays) können je nach Präferenzen der Prüfärzte verwendet werden.

Plattieren Sie 2.000 Zellen (DU145 oder 22Rv1, sowohl elterlich als auch Docetaxel-resistent) pro Well in 6-Well-Platten mit 2 ml Medium pro Well.
Nach 24 Stunden werden steigende Konzentrationen von Docetaxel (Elternzellen: 0,25, 0,5, 1, 2,5 und 5 nM; DR-Zellen: 50, 125, 250, 500 und 1.000 nM) für die Zelllinien DU145 und 22Rv1. Geben Sie DMSO nur in eine Vertiefung als Kontrolle mit der gleichen Lautstärke, die für die höchste Docetaxel-Dosis verwendet wird.
Nach 72 h ist das arzneimittelhaltige Medium zu aspirieren und frisches Docetaxel-freies Medium hinzuzufügen.
Inkubieren Sie die Platten 1-2 Wochen lang, bis die Kolonien unter dem Mikroskop sichtbar sind.
Um die Kolonien zu färben, waschen Sie sie vorsichtig mit 2-3 ml PBS und inkubieren Sie sie mit 2-3 ml kristallvioletter Lösung (0,1 % w/v in 10 % Formalin) für 20 Minuten in der Gewebekulturhaube oder einem Abzug.
Entfernen Sie die Fleckenlösung und waschen Sie die Platten mit 2-3 mL H₂O, entfernen Sie H₂O und trocknen Sie die Platten an der Luft.
Analysieren Sie das Ergebnis, indem Sie die Vertiefungen visualisieren und die Kolonien mit Hilfe eines Markierungsstifts manuell zählen (um zu vermeiden, dass dieselben Kolonien zweimal gezählt werden) und stellen Sie den Prozentsatz der Zellviabilität in einem Diagramm dar. Machen Sie digitale Bilder der Platten für die Darstellung der Figur (Abbildung 1).

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Funktionelle und phänotypische Charakterisierung der Docetaxel-resistenten Zellmodelle. Repräsentative Koloniebildungsassays von elterlichen und Docetaxel-resistenten Zellen, die 72 h lang mit den angegebenen Docetaxel-Konzentrationen behandelt wurden. Der prozentuale Anteil der Kolonien für jede Behandlungskonzentration ist in der beigefügten Grafik dargestellt. Die Experimente sind dreifach und die Daten stellen de...