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1. Vorbereitung des Gels
- Führen Sie SDS-PAGE mit 4 % - 12 % Bis-Tris-Proteingelen (1 mm, 15 Well) unter Verwendung eines Mini-Geltanks durch, der mit 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)-Puffer gefüllt ist.
- Verdünnen Sie die Proben mit einer Mischung aus destilliertem Wasser, Lithiumdodecylsulfat (LDS)-Puffer und einem Probenreduktionsmittel.
- Die erste Bahn wird mit der doppelten Stoffmenge (10 μl) bestückt, gefolgt von der normalen Stoffmenge (5 μl) und einer Reihe von anschließenden zweifachen Verdünnungen des Stoffes (13 Verdünnungen, von 2x bis 8192x).
- Lassen Sie das Gel 30 min lang bei einer konstanten Spannung von 200 V laufen.
2. Fixierung des Gels
- Tauchen Sie die Gele nach der Elektrophorese in eine 100 mL Lösung aus 40 % Ethanol/10 % Essigsäure auf einem Orbitalschüttler bei 50 U/min bei Raumtemperatur 2x (jeweils für 30 min) oder über Nacht bei 4 °C.
- Waschen Sie die Gele jeweils 3 x 10 min in Reinstwasser in einem sauberen Behälter. Der Waschschritt ist entscheidend. Wenn die Säure aus der Fixierlösung im fluorogenen Entwicklungsschritt nicht ordnungsgemäß entfernt wird, wird das überschüssige TPE-4TA durch die Säure aktiviert und führt zu einer starken Hintergrundfluoreszenz im Gel.
3. Herstellung der AgNO3 Lösung und Silberimprägnierung des Gels
- Um die AgNO3-Lösung (0,0001 %) für die Imprägnierung herzustellen, lösen Sie zunächst 0,01 g AgNO3 in 10 mL Reinstwasser, um eine 0,1 %ige AgNO3-Stammlösung herzustellen. Als nächstes fügen Sie 100 μl der 0,1%igen AgNO3-Stammlösung in 100 ml Reinstwasser hinzu, um die Arbeitslösung herzustellen.
Anmerkung: Die AgNO3-Lösung sollte vor der Verwendung im Dunkeln gelagert werden.
- Imprägnieren Sie das Gel mit 100 mL Silber-Arbeitslösung für 1 h auf einem Orbitalschüttler bei 50 U/min in einem verschlossenen Glasbehälter. Es ist wichtig, die Silberimprägnierung unter einem Abzug durchzuführen, der mit Aluminiumfolie vor Licht geschützt ist.
- Waschen Sie das Gel mit Reinstwasser (ca. 100 mL) in einem sauberen Behälter für 2 x 60 s.
4. Fluorogene Entwicklung des Gels
- Zur Herstellung der Farbstoff-Stammlösung (0,1 mM) fügen Sie 3,0 mg des Farbstoffs TPE-4TA in 50 mL Reinstwasser hinzu. Beschallen Sie die Lösung einige Minuten lang und fügen Sie etwas NaOH-Lösung (z. B. 1 M) hinzu, um den Farbstoff aufzulösen.
- Überprüfen Sie die Fluoreszenz der Lösung unter einer 365-nm-UV-Lampe, um sicherzustellen, dass das Farbstoffmolekül vollständig aufgelöst ist. Nur schwache oder nicht emittierende Lösungen deuten auf eine vollständige Auflösung hin.
Anmerkung: Der Farbstoff TPE-4TA wurde nach dem Protokoll synthetisiert, über das Xie et al. kürzlich berichtet haben.Die TPE-4TA-Lösung ist sehr stabil und kann monatelang im Dunkeln aufbewahrt werden.
- Zur Herstellung von 100 mL der fluorogenen Entwicklungslösung (10 μM) geben Sie 10 mL der TPE-4TA-Stammlösung in 90 mL Reinstwasser. Überprüfen Sie den pH-Wert der Lösung mit einem pH-Messgerät und stellen Sie ihn mit einer Natronlauge (1 μM) auf 7 - 9 ein.
- Übertragen Sie das Gel in einen sauberen und verschließbaren Behälter mit 100 mL der fluorogenen Entwicklungslösung. Stellen Sie sicher, dass das Gel vollständig in die Lösung eingetaucht ist. Verschließen Sie den Behälter. Decken Sie es vor Licht ab und schütteln Sie es über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei 50 U/min bei Raumtemperatur. Alternativ kann der Inkubationsschritt auch auf ca. ~2 h verkürzt werden, indem die AIE-Entwicklungslösung für die Färbung auf 80 °C vorgewärmt und dann bei Raumtemperatur belassen wird.
5. Destaining und Imaging
- Füllen Sie das Gel in ein sauberes Gefäß und entfärben Sie es in 100 mL 10% Ethanol für 30 min.
Anmerkung: Zum Waschen des Gels kann nur Wasser verwendet werden. Es ist jedoch zeiteffizienter, eine 10%ige Ethanollösung für die Entfärbung zu verwenden. Dies trägt dazu bei, den Entfärbungsprozess von Stunden auf 30 Minuten zu reduzieren.
- Spülen Sie das Gel 5 Minuten lang in Reinstwasser aus.
- Bilden Sie das Gel am 365-nm-Kanal oder 302-nm-Kanal mit einem Geldokumentationsgerät ab.