>1. Hungerbehandlung für die Larven
HINWEIS: In den Larven des dritten Stadiums gibt es unter normalen Fütterungsbedingungen nur wenige oder keine nachweisbaren Lipidtröpfchen in den Önozyten, aber zahlreiche große Lipidtröpfchen können unter Stressbedingungen, wie z.B. Hunger, in den Önozyten induziert werden. Um diese Methode weiter zu verifizieren, ist es notwendig, diese Larven vorzubehandeln, um die Lipidtröpfchenbiogenese in den Önozyten zu induzieren. Hier wurde ein Hungerzeitverlauf von 12 h, 24 h und 36 h als Paradigma gewählt. Insbesondere ist eine kurze Hungerperiode (z. B. 3 h) ausreichend, um nachweisbare Lipidtröpfchen in Önozyten zu induzieren. Die Dauer des Hungerns kann je nach spezifischen experimentellen Zielen und Einstellungen variieren.
- Stellen Sie Kammern für Hunger- und Kontrollbehandlungen her.
- Für Hungerbehandlungskammern: Legen Sie ein Filterpapier in geeigneter Größe in eine 6 cm Petrischale und pipettieren Sie 1 mL PBS auf das Filterpapier.
- Für Kontrollbehandlungskammern: Geben Sie 5 ml Bloomington Standard-Maismehlfutter in die Petrischale.
- Graben Sie mit einem Spatel vorsichtig die oberste Schicht des Futters aus, das Larven enthält, die sich noch im Futter eingraben, und geben Sie sie in eine Petrischale, die mit 5 ml PBS gefüllt ist. Rühren Sie die Larven vorsichtig in PBS um, um die Larven von Lebensmittelverunreinigungen zu befreien und sie so sauber wie möglich zu machen.
- Verwende einen kleinen Pinsel, um 40 Larven des dritten Stadiums der ungefähren Größe zu sammeln. Sortieren Sie sie nach dem Zufallsprinzip in eine Hunger- oder Kontrollkammer mit jeweils 20 Larven.
- Stellen Sie die Kammern bei 25 °C und 60 % Luftfeuchtigkeit in den Inkubator und lassen Sie sie 12 h, 24 h und 36 h lang verarbeiten.
HINWEIS: Für die Larven in der Hungerkammer fügen Sie alle 12 Stunden 1 ml PBS hinzu, um eine Dehydrierung der Larven zu vermeiden.
>2. Dissektion von Önozyten
- Verwenden Sie einen kleinen Pinsel, um Larven des entsprechenden Alters (12 h, 24 h oder 36 h nach der Behandlung) zu pflücken, und geben Sie sie dann zum Waschen in eine neue Petrischale, die mit 5 ml eiskaltem PBS gefüllt ist.
HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 2.2, wenn Sie mit Larven in einer Kontrollkammer umgehen, um jegliche Lebensmittelkontamination zu entfernen.
- Füllen Sie eine Sezierplatte mit eiskaltem PBS und setzen Sie die Larven mit einer Pinzette vorsichtig in die Sezierplatte um. Legen Sie die Präparierplatte für den folgenden Präparierschritt unter ein Stereomikroskop.
HINWEIS: Die eiskalte Temperatur hilft, die Bewegungen der Larven zu verlangsamen und das Sezieren zu erleichtern.
- Drehen Sie die Larven mit der Bauchseite nach oben und mit der Rückenseite nach unten und halten Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette fest. Befestigen Sie die Larven an der Präparierplatte, indem Sie am vorderen Ende einen Präparierstift durch den Rachen und am hinteren Ende einen weiteren Stift durch den Spiracel stecken.
HINWEIS: Die dorsale Seite ist am einfachsten durch das Vorhandensein der dorsalen Stämme der Luftröhre zu erkennen.
- Mit der Federschere Vannas schneiden Sie die Epidermis vom vorderen zum hinteren Ende in Längsrichtung ein.
- Entfernen Sie das innere Gewebe der Epidermis mit einer Pinzette.
HINWEIS: Bei der Entfernung der Trachealäste ist Vorsicht geboten, um eine Schädigung der Ösozyten zu vermeiden, die sich in der inneren Oberfläche der Epidermis befinden.
- Entnehmen Sie mit einer Pinzette die Dissektionsstifte und übertragen Sie die Epidermis in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das mit PBS auf Eis gefüllt ist.
- Fahren Sie mit dem Präparieren anderer Larven nach dem oben beschriebenen Verfahren fort.
>3. Färben von Lipidtröpfchen
- Inkubieren Sie die präparierte Epidermis im Fixationspuffer für 30 min bei Raumtemperatur (RT) auf einem Rotator.
Anmerkung: Der Fixierungspuffer enthält 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS.
- Entfernen Sie den Fixierpuffer und waschen Sie ihn anschließend schnell. Um eine schnelle Reinigung durchzuführen, geben Sie nach der Entfernung von PFA 1 ml PBS bei RT in das Röhrchen, resuspendieren Sie das Gewebe vorsichtig und entsorgen Sie das PBS.
Vorsicht: Der Fixierpuffer enthält PFA, das für die menschliche Gesundheit schädlich ist. Es ist wichtig, den Fixierpuffer ordnungsgemäß als Sondermüll zu entsorgen.
- Waschen Sie die Proben 3x für jeweils 5 min mit PBS, um alle möglichen PFA-Rückstände auszuwaschen.
- Inkubieren Sie die Epidermis mit BODIPY 493/503 (1 μg/ml; siehe Materialtabelle) für 30 min bei RT auf einem Rotator.
Anmerkung: Wickeln Sie das Mikrozentrifugenröhrchen ab diesem Schritt mit einem Stück Aluminiumfolie ein, um die Proben vor Licht zu schützen und das mögliche Photobleichen zu minimieren.
- Entfernen Sie die Färbelösung BODIPY 493/503 und waschen Sie die Proben 3x für jeweils 10 min mit PBS, um Farbreste vollständig zu entfernen.
>4. Montage und Imaging
- 6 μl Eindeckmedium auf einen sauberen Objektträger geben.
Anmerkung: Das Eindeckmedium wird aufgrund seiner Antifading-Eigenschaften für eine längere Detektionszeit verwendet.
- Nehmen Sie mit einer Pinzette eine Epidermis auf und entfernen Sie vorsichtig mit einem Tuch die PBS-Reste.
- Legen Sie die Epidermis in das Eindeckmedium und stellen Sie ihre Ausrichtung so ein, dass die innere Oberfläche, die die Önozyten enthält, unten und die äußere Oberfläche oben ist.
- Legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf die Epidermis.
Anmerkung: Entfernen Sie bei Bedarf überschüssiges Montagemedium unter dem Deckglas mit einem Tuch. Um die Bildgebung zu erleichtern, drücken Sie das Deckglas vorsichtig mit einer Pinzette nach unten, so dass der Ösozytencluster bei der Betrachtung des Objektträgers durch das Mikroskop leicht in einer einzigen Ebene abgebildet werden kann. Alternativ ist es praktikabel, die Epidermis durch die Mittellinie in zwei Semi-Epidermis zu schneiden, um ein Aufrollen der gesamten Epidermis beim Aufsetzen des Gewebes zu vermeiden.
- Tragen Sie Klarlack um die Ränder des Deckglases auf, um es zu versiegeln.
- Legen Sie die Objektträger in eine lichtdichte Probenbox und lassen Sie den Nagellack bei RT trocknen, was 5-10 min dauern kann.
- Fahren Sie mit der mikroskopischen Analyse fort. Nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop auf (63-fache Vergrößerung mit optimierten GFP- oder FITC-Filtereinstellungen, Anregung = 488 nm, Emission = 503 nm), um saubere und empfindliche Signale mit minimiertem Hintergrund zu erhalten.
