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>1. LCO-Färbelösung
HINWEIS: Wenn hFTAA von einem gewerblichen Anbieter erworben wird, befolgen Sie bitte die Anweisungen des Anbieters anstelle von Abschnitt 1.
- Resuspendieren Sie das lyophilisierte hFTAA in 2 mM NaOH, um eine Stammlösung von 1 mg/ml herzustellen. Bewahren Sie die Brühe in einem Glasfläschchen bei 4 °C auf. Der Bestand kann ein Jahr gelagert werden.
- Bereiten Sie am Tag der Färbung eine Arbeitslösung her, indem Sie den Stamm 1:10.000 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnen.
>2. Vorbereitung von Gewebeproben
HINWEIS: Viele Gewebetypen können mit hFTAA als Amyloid-Marker abgebildet werden. Beispiele finden Sie in Abbildung 1. hFTAA reagiert empfindlich auf die Aggregatkonformation. Die Färbung sollte daher vorzugsweise an ungestörten Aggregaten ohne Epitopfreilegung durchgeführt werden. Eine optimale spektrale Qualität wird erreicht, wenn die Gewebefixierung auf ein Minimum beschränkt wird. Daher wird frisches gefrorenes Material bevorzugt, das zum Zeitpunkt der Färbung schonend in Ethanol fixiert ist. Es ist jedoch möglich, Amyloid-Ablagerungen auch in Gewebe nachzuweisen, das z.B. mit Formalin fixiert wurde. hFTAA dringt in der Regel gut in das Gewebe ein. Wählen Sie eine Probendicke, die mit dem vorgesehenen bildgebenden Verfahren kompatibel ist.
- Werden formalinfixierte, in Paraffin eingebettete Abschnitte verwendet, die über Nacht in Xylol entparaffinisiert werden. Tauchen Sie die Abschnitte jeweils 10 min in aufeinanderfolgende Bäder mit 99 % Ethanol, 70 % Ethanol, dH2O und PBS. Lassen Sie die Gewebeschnitte unter Umgebungsbedingungen trocknen. Achtung: Xylol wird immer in einem chemischen Abzug gehandhabt. Xylol und andere organische Lösungsmittel sind schädlich.
- Kryosektionen bei Raumtemperatur auftauen. Fixieren Sie die Gewebeabschnitte über Nacht in 10 % Formalin und rehydrieren Sie, indem Sie sie jeweils 10 Minuten lang in aufeinanderfolgende Bäder mit 99 % Ethanol, 70 % Ethanol, dH2O und PBS tauchen. Lassen Sie die Gewebeschnitte unter Umgebungsbedingungen trocknen.
- Geben Sie Tröpfchen der hFTAA-Arbeitslösung (ca. 200 μl) zu den Gewebeschnitten, um sie zu bedecken. Das Tröpfchen sollte durch die Oberflächenspannung an Ort und Stelle bleiben. Zum Färben 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Spülen Sie die Färbelösung mit 500 μl PBS mit einer Pipette ab und tauchen Sie den Objektträger dann für 10 min in das PBS-Bad. Lassen Sie den Schnitt unter Umgebungsbedingungen trocknen.
- Montage mit dem Fluoreszenz-Eindeckmedium. Lassen Sie das Eindeckmedium über Nacht absetzen.
HINWEIS: Die hFTAA-Färbung kann in Kombination mit anderen Färbemethoden wie Immunfluoreszenz, zell- oder organellenspezifischen Markern usw. durchgeführt werden. Um eine Co-Färbung durchzuführen, führen Sie das vollständige Färbeprotokoll Ihrer Wahl aus und fügen Sie am Ende eine hFTAA-Färbung hinzu, beginnend mit Schritt 2.2. Beispiele finden Sie in Abbildung 2. Für die Immunfluoreszenz ist vorzugsweise ein Sekundärantikörper auszuwählen, der bei 640 nm oder höher angeregt wird. In diesem Wellenlängenbereich absorbiert hFTAA nicht und kann daher nicht angeregt werden und fluoresziert nicht. Dadurch wird sichergestellt, dass kein Durchscheinen zwischen hFTAA und Antikörper zu sehen ist.
