Tartrat-resistente saure Phosphatase-Färbung: Eine In-vitro-Technik zum Nachweis von TRAP-Enzym-haltigen kultivierten Osteoklasten

Zusammenfassung

Quelle: Dai, Q., et al. Ein RANKL-basierter Osteoklastenkultur-Assay aus Mausknochenmark zur Untersuchung der Rolle von mTORC1 bei der Osteoklastenbildung. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert die tartratresistente saure Phosphatase-Färbetechnik zum Nachweis des Vorhandenseins von TRAP-haltigen Granulaten in Osteoklasten. Die Technik bildet magentafarbene Farbstoffgranulatablagerungen im Zytoplasma von Osteoklasten und macht sie unter einem inversen Mikroskop sichtbar.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung

1. Generierung von Osteoklasten-spezifischen Raptor-Deletionsmäusen (Raptor^fl/fl; Ctsk-cre, im Folgenden Rap^Ctsk) durch Verpaarung von Raptor^{fl/fl-Mäusen} mit Ctsk-cre-Mäusen. Verwenden Sie in dieser Studie die Raptor^fl/fl-Mäuse als WT-Kontrolle.
2. Halten Sie einen Behälter mit Eis bereit, um isolierte Knochen aufzubewahren.
3. Bereiten Sie das Nährmedium vor.
   1. Bereiten Sie α-MEM-Nährmedium vor, indem Sie mindestens essentielles Medium alpha (α-MEM) mit 1x Glutamin, Penicillin-Streptomycin und 10 % fötalem Kälberserum ergänzen.
   2. Bereiten Sie ein Knochenmarkmakrophagen-Induktionsmedium vor, das aus 50 ml α-MEM-Medium und M-CSF mit 20 ng/ml besteht.
   3. Osteoklasten-Induktionsmedium bestehend aus M-CSF und RANKL mit 20 ng/ml in 50 ml α-MEM-Medium herstellen.
4. Bereiten Sie die folgenden Puffer vor, bevor Sie mit der TRAP-Färbung beginnen.
   1. Bereiten Sie eine Fixlösung vor, die aus 6,5 mL Aceton, 2,5 mL Citratlösung und 0,8 mL 37% (vol/vol) Formaldehydlösung besteht.
   2. Bereiten Sie die TRAP-Färbelösung vor.
      1. Deionisiertes Wasser auf 37 °C vorwärmen.
      2. 100 μl schnelle Granat-GBC-Basislösung und 100 μl Natriumnitritlösung in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen geben und durch sanftes Wenden 30 s lang mischen. Die Mischung 2 Minuten ziehen lassen.
      3. 9 ml deionisiertes Wasser auf 37 °C vorwärmen. 200 μl diazotisierte schnelle Granat-GBC-Basislösung aus Schritt 1.4.2.2, 100 μl Naphthhol-AS-BI-Phosphatlösung, 400 μl Acetatlösung und 200 μl Tartratlösung hinzufügen.
      4. Bewahren Sie die TRAP-Lösung für die Färbemischung in einem Wasserbad bei 37 °C auf.

>2. Sezieren (Tag-1)

1. 3 einmonatige weibliche WT- und ^{Rap Ctsk-Mäuse} separat durch CO₂ einschläfern. Führen Sie die CO₂ -Inhalation mit geeigneter Ausrüstung durch geschultes Personal durch.
2. Tauchen Sie 6 Mäuse 5 Minuten lang in ein Becherglas mit 100 ml 75 % Ethanol (vol/vol), um eine bakterielle Kontamination zu verhindern, und legen Sie sie dann in Rückenlage auf ein Sezierbrett. Machen Sie einen Schnitt am distalen Bereich der Tibia vertikal und präparieren Sie die Haut entlang der hinteren Extremität mit einer Augenschere.
3. Schneiden Sie das Gelenkband des Hüftgelenks mit einer Schere ab und verrenken Sie die hinteren Gliedmaßen aus dem Rumpf.
4. Schneiden Sie das Gelenkband des Kniegelenks ab und lösen Sie vorsichtig das Schienbein und den Oberschenkelknochen vom Kniegelenk. Entfernen Sie das Weichgewebe vorsichtig mit einer Schere.
5. Platzieren Sie alle Knochen eines Genotyps in jeder Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit 2 mL α-MEM auf Eis.
   Anmerkung: Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, sollte der Knochen weniger als 1 Stunde unter diesen Bedingungen gehalten werden.

>3. Isolation (Tag-1)

1. Füllen Sie eine Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit 75 % Ethanol (3 mL) und die anderen 5 Wells mit α-MEM-Medium (3 mL).
2. Legen Sie alle Knochen eines Genotyps für 15 s in die Ethanolwäsche und waschen Sie die Knochen 5 Mal für jeweils 10 s mit α-MEM-Medium.
3. Schneiden Sie die Epiphysen mit der Schere ab und führen Sie eine 0,45-mm-Spritzennadel in die Knochenhöhle ein und spülen Sie das Mark mit α-MEM-Medium in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen aus.
4. Spülen Sie die Knochenhöhle mit der gleichen Methode vom anderen Ende des Knochens aus. Wiederholen Sie dies mindestens zweimal, um die Knochenhöhle gründlich zu waschen, bis der Knochen blass ist.
5. Das Knochenmark wird zentrifugiert, um ein Zellpellet bei 800 x g und 4 °C für 5 min zu erhalten. Der Überstand wird aspiriert.
6. Geben Sie 3 ml Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen in das Zentrifugenröhrchen und pipettieren Sie vorsichtig, um das Knochenmark wieder zu suspendieren. Halten Sie das Zentrifugenröhrchen 8 Minuten lang auf Eis, um die roten Blutkörperchen zu lysieren.
7. Geben Sie 6 ml α-MEM-Medium in das Zentrifugenröhrchen, um die Zelllyse zu stoppen. Bei 500 x g und 4 ΰC für 10 min zentrifugieren und den Überstand ansaugen.
8. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml α-MEM-Kulturmedium und legen Sie die Zellen in eine Sechs-Well-Platte (in der Regel eine Maus pro Well).
Über
9. Nacht bei 37 °C in einem 5 % CO₂ -Inkubator inkubieren.

>4. Plattieren (Tag 0)

1. Übertragen Sie den Überstand in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen, um die ungebundenen Zellen am nächsten Morgen zu sammeln.
2. Bei 800 x g und 4 ΰC 5 min zentrifugieren und den Überstand aspirieren.
3. Resuspendieren Sie in 4 mL α-MEM-Kulturmedium.
4. Nehmen Sie 20 μl der Zelllösung und mischen Sie sie mit 20 μl Trypanblau. Geben Sie 10 μl der Mischung in die Zählkammer und ermitteln Sie die Zellzahl pro ml Lösung.
5. Fügen Sie ein geeignetes Volumen α-MEM-Nährmedium hinzu, um eine Zelllösung von 500.000 Zellen/ml zu erhalten.
6. Geben Sie 500 μl und 50 μl Knochenmarkmakrophagen-Induktionsmedium in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte bzw. einer 96-Well-Platte.
7. Geben Sie 500 μl und 50 μl Zelllösung in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte bzw. einer 96-Well-Platte.
Bei
8. 37 °C in einem 5 % CO₂ -Inkubator 3 Tage lang inkubieren.

>5. Differenzierung (Tage 3-7)

1. Drei Tage nach dem Plattieren 50 μl Medium aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte auffangen und bei -20 °C einfrieren, dann das Restmedium absaugen.
2. Geben Sie 1 ml und 100 μl Osteoklasten-Induktionsmedium in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte bzw. einer 96-Well-Platte.
2
3. Tage lang bei 37 °C inkubieren.
4. Sammeln Sie 50 μl Medium aus jeder Vertiefung und saugen Sie das Restmedium an.
5. Geben Sie Osteoklasten-Induktionsmedium in jede Vertiefung.
1
6. Tag lang bei 37 °C inkubieren.
   Anmerkung: Zu diesem Zeitpunkt sollten große, mehrkernige Osteoklasten unter einem inversen Mikroskop betrachtet werden (Abbildung 1A).
7. Wenn keine Osteoklasten zu sehen sind, wechseln Sie das Osteoklasten-Induktionsmedium und beobachten Sie täglich, bis Osteoklasten zu sehen sind.
8. Sammeln Sie 50 μl Medium aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte, nachdem sich die Osteoklasten gebildet haben.

>6. Färbung mit tartratresistenter saurer Phosphatase (TRAP)

HINWEIS: Reife Osteoklasten können nach 6-7 Tagen In-vitro-Kultur (Schritt 4) vorhanden sein.

1. Medium ansaugen und 3 Mal schonend mit 1x PBS waschen.
2. Fixieren Sie die Zellen in jeder Vertiefung der 96-Well-Platte mit 100 μl Fixierlösung für 30 s bei Raumtemperatur.
3. Nach der Fixierung die Fixierlösung aspirieren und 3 Mal vorsichtig mit deionisiertem Wasser waschen, das auf 37 °C vorgewärmt ist. Deionisiertes Wasser ansaugen.
4. Geben Sie 100 μl TRAP-Färbung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und legen Sie die Platte 30 Minuten lang bei 37 °C in einen Inkubator und schützen Sie sie vor Licht.
5. Aspirieren Sie nach dem Färben den TRAP-Fleck und waschen Sie ihn vorsichtig 3 Mal mit entionisiertem Wasser.
6. Nehmen Sie Osteoklasten mit einem inversen Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung auf.

Ergebnisse

Abbildung 1: Repräsentative Ansicht von Osteoklasten.(A) Riesige Osteoklasten im Hellfeld an Tag 6 beobachtet. Die rote Linie umriss die Grenze der Osteoklasten. (B) Ein typisch riesiger, mehrkerniger, TRAP-positiver (weinroter) Osteoklaste. Der schwarze Pfeil zeigte zwei Kerne des mehrkernigen Osteoklasten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Raptorfl/fl-Mäuse	Das Jackson-Labor	Artikel-Nr.: 13188
Ctsk-cre-Mäuse			ein Geschenk von S. Kato, University of Tokyo, Tokio, Japan
α-MEM	Corning	10-022-CVR
Glutamin	Gibico	25030081
Penicillin-Streptomycin	Gibico	15140122
Fötales Kälberserum	BioInd	04-001-1A
Rekombinantes Maus-M-CSF-Protein	Forschung und Entwicklung	Q3U4F9
Rekombinantes Maus-RANKL-Protein	Forschung und Entwicklung	Frage 3TWY5
Erythrozyten-Lysepuffer	Beyotime	Nr. C3702
Trypan-Blau	Sigma-Aldrich	302643
Aceton	Shanghai Chemical Co., Ltd.
Citrat-Lösung	Sigma-Aldrich	915
Formaldehyd-Lösung	Shanghai Chemical Co., Ltd.
Saure Phosphatase, Leukozyten (TRAP) Kit	Sigma-Aldrich	387A-1KT
Schnelle Garnet GBC Base-Lösung	Sigma-Aldrich	3872
Natriumnitrit-Lösung	Sigma-Aldrich	914
Naphthol AS-BI Phosphat Lösung	Sigma-Aldrich	3871
Acetat-Lösung	Sigma-Aldrich	3863
Tartrat-Lösung	Sigma-Aldrich	3873
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung von Dulbecco	Corning	21-031-CVR
37% Formaldehyd	Xilong wissenschaftlich
IX71	Olymp
0,45-mm-Spritze
Schere
Mückenzange

kg kg kg kg