Alizarin-Rot-Färbung: Eine Technik zur Visualisierung der Mineralisierung durch kultivierte Osteoblasten

Zusammenfassung

Quelle: Kampleitner, C., et al. Biologisches Kompatibilitätsprofil auf Biomaterialien für die Knochenregeneration. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt eine Färbetechnik zum Nachweis des Ausmaßes der Mineralisierung oder Kalziumablagerung in kultivierten primären Osteoblasten unter Verwendung des Farbstoffs Alizarinrot.

Protokoll

>1. Osteoblast (OB)-Mineralisierung, beurteilt durch Färbung mit Alizarin Red S (ARS)

1. Fügen Sie primäre Osteoblasten (OBs) zu den β-Tricalciumphosphat (β-TCP)-Scheiben hinzu, die als biokompatibles Gerüst in einer Kulturplatte verwendet werden.
2. Aspirieren Sie das Kulturmedium 14 Tage nach der Zugabe des Mineralisierungsmediums aus den Vertiefungen, die primäre OBs enthalten, und spülen Sie zweimal mit 0,5 mL 1x PBS bei RT. Aspirieren Sie das PBS und fixieren Sie die Zellen, indem Sie 0,5 mL der 10%igen gepufferten Formalinlösung bei RT für 10 Minuten hinzufügen.
3. Aspirieren Sie das 10% gepufferte Formalin mit einer Einwegpipette und waschen Sie es zweimal mit 0,5 ml Reinstwasser.
4. Zu den fixierten OBs werden 0,25 ml 40 mM ARS-Färbelösung (pH 4,2) gegeben, die in Reinstwasser gelöst ist, und die Platte 10 Minuten lang bei RT auf einem Schüttler bei 100 Schütteln/min inkubiert.
5. Aspirieren Sie die Färbelösung mit einer Einwegpipette und spülen Sie sie mit 1 ml Reinstwasser ab. Wiederholen Sie diesen Schritt 5–10 Mal, um unspezifische Flecken zu entfernen.
   Anmerkung: Die Spüllösung sollte ohne Farbe sein.
6. Aspirieren Sie das Reinstwasser und fügen Sie 1 ml kaltes PBS hinzu. Inkubieren Sie die Platte 10 Minuten lang bei RT auf einem Shaker bei 100 Schütteln/min.
7. Aspirieren Sie das PBS, übertragen Sie die gefärbten β-TCP-Platten in ein neues Bohrloch und scannen Sie die Platten mit einem Flachbettscanner, um die Mineralisierung aufzuzeichnen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
β-Tricalciumphosphat-Scheiben (β-TCP, 14 mm)			Die Scheiben wurden in einem Muffelofen bei einer Temperatur von 1150 °C gesintert. Eine detaillierte Beschreibung der Produktion findet sich in Zimmer et al. (doi: 10.1002/jbm.a.34639). Die Proben wurden vor der Verwendung in Zellkulturen UV-bestrahlt (15 min für jede Seite).
Orthovita Vitoss Schaum (β-TCP/C Schaum)	Orthovita	Tel.: 2102-1405
Alizarin Rot S	Sigma-Aldrich	Nr. A5533
Formalinlösung neutral gepuffert 10%	Sigma-Aldrich	HT501128
Osteogenes Mineralisierungsmedium (MM)			α-MEM + 10 % hitzeinaktiviertes FBS + 1 % Penicillin-Streptomycin + 50 μg/ml Ascorbinsäure + 5 mM β-Glycerophosphat
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Reinstwasser: Zellkulturwasser pyrogenfrei	VWR	Nr. L0970-500
Puffer waschen			Addieren Sie 0,05 % Tween20 zu 1x PBS.
24-Well-Suspensionskulturplatte	Greiner bio-one	662102
Flachbettscanner: Epson Perfection 1200 Foto	Epson
Einwegpipette: Serumpipette	Greiner bio-one	612301
destilliertes Wasser	Carl Roth	3478,4
Einwegpipette: Serumpipette	Greiner bio-one	612301

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