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>1. Protokoll zur Silberfärbung
- Bereiten Sie alle für die Silberfärbung erforderlichen Lösungen im Voraus vor (Tabelle 1).
Anmerkung: Berühren Sie das PAGE-Gel nicht direkt, bis es gefärbt, entwickelt und in Stopplösung gegeben wurde. Manipulieren Sie das Gel stattdessen mit sauberen Plastik- oder Glaswerkzeugen. Die direkte Handhabung des Gels führt nach dem Färben zu Fingerabdruckverzerrungen und anderen sichtbaren Artefakten auf dem Gel.
- Sobald der Lauf abgeschlossen ist, zerlegen Sie die Kassette und extrahieren Sie das Gel in einem sauberen, mittelgroßen Behälter, der mit deionisiertem, gefiltertem Wasser gefüllt ist.
Anmerkung: Um eine direkte Handhabung des Gels zu vermeiden, verwenden Sie eine Pipettenspitze oder einen anderen Kunststoffgegenstand, um das Gel vorsichtig von der Kassette abzuziehen, während Sie es in Wasser tauchen. Das Gel kann zerbrechlich sein - vorsichtig damit umgehen.
- Entsorge das Wasser. Färben Sie das Gel 5 Minuten lang in Alcianblau-Färbelösung.
- Alcian-Blau-Fleck entsorgen. 2-3x schnell mit entionisiertem, gefiltertem Wasser spülen/waschen, bis der größte Teil der Alcianblau-Färbelösung entfernt ist.
- In entionisiertem, gefiltertem Wasser über Nacht auf einer Wippe entfärben lassen. Stellen Sie sicher, dass ausreichend deionisiertes, gefiltertes Wasser vorhanden ist, um sicherzustellen, dass alle verbleibenden Flecken über Nacht vollständig vom Gel abgewaschen werden.
- Gel in 50% Methanol waschen (insgesamt 40 min, Lösung 2-3x wechseln).
- Waschen Sie das Gel 30 Minuten lang in entionisiertem, gefiltertem Wasser. Entsorgen Sie das Wasser und wiederholen Sie dies 3 weitere Male für insgesamt 2 Stunden, wobei Sie das Wasser jedes Mal ersetzen.
- Färben Sie das Gel in einem frischen, sauberen Behälter 30 Minuten lang in Silbernitrat-Färbelösung.
- 2-3x schnell in entionisiertem, gefiltertem Wasser spülen/waschen, um die Silberfleckenlösung vollständig zu entfernen.
- 30 Minuten in entionisiertem, gefiltertem Wasser waschen. Entsorgen Sie das Wasser und wiederholen Sie dies 2x für insgesamt 90 Minuten, wobei Sie das Wasserbad jedes Mal ersetzen.
- Entsorgen Sie das Wasser und fügen Sie die Entwicklungslösung hinzu.
- Sobald die Entwicklungslösung hinzugefügt wurde, beobachten Sie das Gel sorgfältig und achten Sie auf das Auftreten von Bändern. Abhängig von der Qualität des Färbemittels und der Masse der geladenen Probe kann die Entwicklung zwischen wenigen Sekunden und mehreren Minuten dauern.
- Sobald die gewünschten Streifen sichtbar sind, sofort die Entwicklungslösung entsorgen und kurz mit Stopplösung waschen.
- Entsorgen Sie die Stopplösung, waschen Sie sie und ersetzen Sie sie durch frische Stopplösung. 1 h auf einer Wippe oder einem Shaker einweichen lassen.
- Über Nacht in entionisiertem, gefiltertem Wasser waschen (das Gel kann jedoch sofort nach dem Waschen der Stopplösung abgebildet werden).
Tabelle 1: Lösungen, die für die Silberfärbung von Glykosaminoglykanen erforderlich sind, die durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt werden. Alle Lösungen müssen vor der Verwendung filtriert werden (0,22 μm).
| HINWEIS: Alle Lösungen müssen vor der Verwendung gefiltert werden (0,22μm). |
| Lösung | Rezept | Zusammensetzung | Kommentare |
| Alcianblau-Färbelösung (500mL) | Alcianblau 8GX Pulver | 2,5 g | Gewünschte Konzentration: 0,5 % w/v |
| 2 % v/v Eisessig | 500 ml | |
| Silberfleck (200 mL) | Deionisiertes Wasser | 192,7 mL | Bereiten Sie die Fleckenlösung frisch zu und verwenden Sie sie innerhalb einer Woche. |
| 7.6M Natriumhydroxid | 2 mL | Zur Herstellung 3,04 g Natriumhydroxid-Pellets in 10 ml Wasser geben |
| Ammoniakwasser | 3,3 mL | |
| 4M Silbernitrat-Lösung | 2 mL | Zur Herstellung 3.397 g Silbernitrat in 5 mL Wasser geben. Unter Rühren tropfenweise hinzufügen, um Ausfällungen zu vermeiden. |
| Entwicklung der Lösung (501 ml) | Deionisiertes Wasser | 500 mL | Die Entwicklungslösung muss innerhalb von 24 Stunden frisch hergestellt und verwendet werden. |
| 2,5 % w/v Zitronensäure | 1 mL | Zur Herstellung 100 mg auf 4 ml deionisiertes Wasser geben. Zitronensäure muss frisch gemacht werden. |
| Formaldehyd | 250μL | |
| Stopp-Lösung (500 mL) | Deionisiertes Wasser | 300 mL | |
| Eisessig | 20 mL | |
| Methanol | 90 mL | |